萬小旭,張　行,王佳賀*

白花蛇舌草的有效成分2-羥基-3-甲基蒽醌通過Fas/FasL信號通路誘導(dǎo)卵巢癌細胞凋亡

萬小旭a,張行b,王佳賀a*

[摘要]目的研究中藥白花蛇舌草的有效成分2-羥基-3-甲基蒽醌對人卵巢癌細胞HO-8910生長的抑制作用和凋亡的影響。方法不同濃度的2-羥基-3-甲基蒽醌與人卵巢癌細胞HO-8910分別培養(yǎng)0、24、48、72 h，用臺盼藍染色法測定HO-8910細胞存活率；以Annexin V FITC/PI 雙染流式細胞儀檢測HO-8910細胞的凋亡率；Western blot法檢測Fas和FasL蛋白的表達；采用熒光比色法測定Caspase-3和Caspase-8蛋白酶的活性。結(jié)果隨著2-羥基-3-甲基蒽醌濃度的增加及作用時間的延長，藥物對HO-8910細胞的生長有明顯的抑制作用；HO-8910細胞的凋亡率亦隨之增高，且呈藥物濃度及時間依賴關(guān)系；2-羥基-3-甲基蒽醌作用HO-8910細胞后Fas和FasL的蛋白表達水平逐漸上升；Caspase-3和Caspase-8蛋白酶的表達亦逐漸增強；Caspase-3和Caspase-8抑制劑能夠抑制2-羥基-3-甲基蒽醌誘導(dǎo)的HO-8910細胞凋亡。結(jié)論2-羥基-3-甲基蒽醌可以誘導(dǎo)HO-8910細胞凋亡，F(xiàn)as/FasL通路在2-羥基-3-甲基蒽醌誘導(dǎo)的HO-8910細胞凋亡過程中起重要作用。

[關(guān)鍵詞]白花蛇舌草；2-羥基-3-甲基蒽醌；HO-8910；凋亡

[Abstract]ObjectiveTo explore the effects of 2-Hydroxy-3-methylanthraquinone from Hedyotis diffusa on proliferation and apoptosis of human ovarian cancer cells HO-8910 and the expressions of Fas/FasL proteins.MethodsHO-8910 cells were cultured with different concentrations of 2-Hydroxy-3-methylanthraquinoe at different time points. Cell proliferation was detected by trypan blue stain；cell apoptosis was examined by flow cytometry；and the Fas/FasL protein was detected by Western blot assay.The activity of caspases was detected by colorimetric assay.Results2-Hydroxy-3-methylanthraquinoe induced apoptosis of HO-8910 cells in a time- and dose-dependent manner. The expression of Fas and FasL proteins increased after treatment by 2-Hydroxy-3-methylanthraquinoe. Moreover,treatment of HO-8910 cells with 2-Hydroxy-3-methylanthraquinoe resulted in activation of caspase-3 and caspase-8.The caspases inhibitors decreased apoptosis in HO-8910 cells.Conclusion2-Hydroxy-3-methylanthraquinoe can enhance the apoptosis of HO-8910 cells through Fas/FasL signaling pathway.

收稿日期：2015-04-16

通信作者*

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201512002

2-Hydroxy-3-methylanthraquinone fromHedyotisdiffusaWilldinduces the apoptosis of HO-8910 cells through Fas/FasL signaling pathwayWAN Xiao-xua,ZHANG Hangb,WANG Jia-hea*(a.Department of Geriatrics，b.Department of Laryngology，Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Key words：HedyotisdiffusaWilld；2-Hydroxy-3-methylanthraquinone;HO-8910 cells；Apoptosis

0引言

卵巢癌是指生長在卵巢的惡性腫瘤。由于卵巢癌早期缺乏特異性癥狀，所以診斷比較困難，而晚期患者又療效不佳[1]。白花蛇舌草是茜草科耳草屬的植物[2]，最近研究表明，白花蛇舌草的有效成分2-羥基-3-甲基蒽醌對前列腺癌、胃癌、宮頸癌、乳腺癌、胰腺癌等多種腫瘤細胞具有明顯的增殖抑制作用[3-5]。并有研究指出,白花蛇舌草注射液可以誘導(dǎo)卵巢癌細胞SKOV-3凋亡[6]。但2-羥基-3-甲基蒽醌對卵巢癌細胞株HO-8910細胞的抗腫瘤作用至今未見國內(nèi)外相關(guān)報道。

本實驗采用2-羥基-3-甲基蒽醌作用于體外培養(yǎng)的卵巢癌細胞HO-8910，用臺盼藍染色法檢測不同濃度的藥物作用不同時間后對卵巢癌HO-8910細胞的抑制作用，Annexin V FITC/PI 雙染流式細胞術(shù)觀察2-羥基-3-甲基蒽醌作用于卵巢癌HO-8910細胞后對其凋亡的影響，以及Western blot法檢測Fas/FasL信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在此凋亡過程中的作用，為臨床卵巢癌患者的治療提供一定的理論參考。

1材料和方法

1.1材料人卵巢癌細胞株HO-8910 由中國醫(yī)科大學(xué)中心實驗室提供;細胞培養(yǎng)試劑購自Invitrogen 公司；Fas/FasL抗體、Caspase-3及Caspase-8抑制劑及其他所有試劑均購自Sigma 公司。離心機購自德國Eppendorf 公司;流式細胞儀購自美國Backman公司。2-羥基-3-甲基蒽醌購自上海樊克生物科技有限公司。

1.2HO-8910細胞培養(yǎng)HO-8910 細胞使用 DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞貼壁生長在含10% 胎牛血清及100 U/mL青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的培養(yǎng)液中，細胞于5% CO2、飽和濕度及37℃條件下常規(guī)培養(yǎng)，隔日傳代，取對數(shù)生長期的細胞用于下一步實驗。

1.32-羥基-3-甲基蒽醌作用于HO-8910細胞當2-羥基-3-甲基蒽醌的濃度分別為0、25、50、100 μM時，與HO-8910細胞分別培養(yǎng)0、24、48、72 h。

1.4細胞活力測定收集對數(shù)生長期的HO-8910細胞，PBS洗3次，分裝于24孔板，加入不同濃度的2-羥基-3-甲基蒽醌，每組設(shè)4個平行孔。細胞加藥后置于37 ℃、5% CO2飽和濕度孵箱分別培養(yǎng)0、24、48、72 h，加入臺盼藍染色，用臺盼藍拒染法在鏡下計數(shù)活細胞數(shù)。細胞死亡率為染成藍色細胞占總細胞的百分率。

1.5Annexin V FITC/PI 雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡收集處于對數(shù)生長期的HO-8910細胞，分別加入0、25、50、100 μM的2-羥基-3-甲基蒽醌，分別培養(yǎng)0、24、48、72 h后收集細胞，用PBS 洗細胞2次，離心 5 min (2 000 r/min)后取106細胞，加入60 μL的Binding Buffer 重懸;加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，再加入5 μL Propidium Iodide 混勻，并于室溫下避光反應(yīng) 15 min，細胞結(jié)合Annexin V-FITC 和PI 后，其結(jié)果采用CellQuest軟件用流式細胞儀(FACS Calibur，BD Biosciences)進行分析。每個樣品至少計數(shù)10 000個細胞。

1.6Western blot 檢測各組細胞中Fas/FasL蛋白水平的表達2-羥基-3-甲基蒽醌(0、25、50、100 μM)分別處理0、24、48、72 h后，常規(guī)消化收集各組HO-8910細胞，按總蛋白抽提試劑盒操作步驟提取樣本細胞總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度。等量蛋白用12%的SDS-聚丙烯酰氨凝膠 (SDS-PAGE)電泳。在恒定電流下電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，置于5%脫脂奶粉中予以室溫封閉2 h。加入1∶1 000 稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜;TBST 洗膜 3 次;加入稀釋的二抗(1∶6 000)，室溫孵育1 h；TBST 洗膜3次，每次15 min。用抗β-actin 抗體標記。所有測量結(jié)果用抗β-actin 蛋白標志標準化。按PIERCE 化學(xué)發(fā)光試劑盒說明，用發(fā)光試劑浸潤PVDF膜，X 線膠片在感光屏內(nèi)曝光成像，結(jié)果在凝膠成相儀上照相。同一實驗重復(fù)3 次。

1.7細胞內(nèi)Caspase-3和Caspase-8蛋白酶活性測定收集并裂解對照組和2-羥基-3-甲基蒽醌處理組細胞，冰上孵育10 min后，4 ℃離心(10 000 r/min)10 min，收集上清液，測定蛋白濃度(BCA Protein Assay Reagent Kit，Pierce Biotechnology，美國)。分別加入反應(yīng)緩沖液/DTT 混合物及特異性的熒光Caspase-3和Caspase-8底物，37 ℃水浴1 h。通過熒光分光光度計定量檢測Caspases-3和Caspase-8蛋白酶的活性(激發(fā)波長370 nm，發(fā)射波長460 nm)。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 10.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，細胞凋亡率用±s表示。多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1細胞活力測定臺盼藍染色結(jié)果顯示，隨著2-羥基-3-甲基蒽醌的濃度增加及作用時間的延長，各實驗組染成藍色的細胞逐漸增多,提示壞死HO-8910細胞逐漸增多,HO-8910細胞存活率逐漸下降，結(jié)果見圖1。

圖1　2-羥基-3-甲基蒽醌對卵巢癌HO-8910細胞生長的影響

2.2Annexin V FITC/PI雙染流式細胞儀檢測卵巢癌細胞系HO-8910細胞的凋亡情況結(jié)果見圖2。不同濃度的2-羥基-3-甲基蒽醌作用于卵巢癌細胞系HO-8910細胞不同時間后細胞均發(fā)生凋亡，并且HO-8910的凋亡率隨著2-羥基-3-甲基蒽醌濃度的增加及培養(yǎng)時間的延長而升高。當2-羥基-3-甲基蒽醌濃度為50 μM時，作用24、48、72 h后，HO-8910細胞的凋亡率與0 h比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；當2-羥基-3-甲基蒽醌濃度分別為25、50、100 μM時，培養(yǎng)48 h后，HO-8910細胞的凋亡率與0 μM比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2　Annexin V FITC/PI 雙染流式細胞儀檢測卵巢癌細胞

2.32-羥基-3-甲基蒽醌對Fas/FasL信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響50 μM 的2-羥基-3-甲基蒽醌作用不同時間后，免疫印跡法檢測Fas/FasL蛋白的表達。結(jié)果顯示，隨著藥物作用時間的延長，F(xiàn)as/FasL蛋白的表達亦逐漸增加，見圖3。

圖3　2-羥基-3-甲基蒽醌(50 μM)作用于卵巢癌細胞HO-8910

2.4Caspase-3及Caspase-8活性測定當2-羥基-3-甲基蒽醌濃度為50 μM時，隨著作用時間的延長，caspase-3及Caspase-8蛋白酶的活性亦逐漸增加。作用24、48、72 h后與0 h比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.001)。當2-羥基-3-甲基蒽醌濃度分別為25、50、100 μM時，培養(yǎng)48 h后，caspase-3、Caspase-8的活性隨著2-羥基-3-甲基蒽醌濃度的增加而升高，與0 μM比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見圖4。

2.5Caspase-3及Caspase-8抑制劑對HO-8910細胞凋亡率的影響加入Caspase-3及Caspase-8抑制劑后，HO-8910細胞的凋亡率與加入50 μM的2-羥基-3-甲基蒽醌相比明顯降低，結(jié)果見圖5。

圖4　2-羥基-3-甲基蒽醌作用于卵巢癌細胞HO-8910后

圖5　Annexin V FITC/PI 雙染流式細胞儀分析檢測加入Caspase-3

3討論

雖然卵巢癌的發(fā)病率低于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，居婦科惡性腫瘤的第3位，但死亡率卻高居婦科癌癥的首位，嚴重威脅著女性的健康和生命安全[7-8]。大量實驗研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)中藥抗腫瘤藥物均可誘導(dǎo)敏感的卵巢癌細胞發(fā)生凋亡，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用[9-10]。白花蛇舌草分布在日本以及中國大陸的南方等地[11]，多生長于山地巖石上，生長于海拔1 800米的地區(qū)。其中成藥味苦、淡。常用于治療腫瘤、熱癥、腸胃痛、泌尿系統(tǒng)疾病等[12-14]。但是，目前關(guān)于白花蛇舌草抗腫瘤的機制，特別是對體外培養(yǎng)的卵巢癌細胞株的影響國內(nèi)外尚無更深入的研究，還不能從根本上對該藥的抗卵巢癌作用及其機制進行解釋。

細胞凋亡是由基因控制的程序性細胞死亡，其機制較為復(fù)雜[15-16]。對人類來說，誘導(dǎo)細胞凋亡主要有外源性(死亡受體介導(dǎo)通路)和內(nèi)源性(線粒體凋亡通路)兩條途徑[17]。Fas/FasL 通路又稱死亡受體通路，在細胞增殖、降解和細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的作用[18]。Fas是腫瘤壞死因子受體之一，是一種由325 個氨基酸組成的跨膜蛋白受體分子，又稱CD95。Fas能通過與其配體FasL 結(jié)合而誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡[19]。Fas 主要是通過胞內(nèi)段的DD (Death domain)和FADD (Fas-associating protein with death domain)羧基端的DD 之間的相互作用，募集細胞質(zhì)中的銜接蛋白FADD;FADD 再通過死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域與Caspase-8 結(jié)合形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體，從而激活Caspase-8及其下游的Caspase 家族成員，最終誘導(dǎo)細胞凋亡[18]。 本課題應(yīng)用臺盼藍染色法檢測不同作用時間、不同濃度的2-羥基-3-甲基蒽醌對卵巢癌細胞株HO-8910 細胞的生長抑制情況。結(jié)果表明，隨著2-羥基-3-甲基蒽醌濃度的升高、作用時間的延長，卵巢癌HO-8910 細胞的死亡率不斷上升，呈劑量-時間依賴關(guān)系。Annexin V FITC/PI 雙染流式細胞儀分析結(jié)果表明，2-羥基-3-甲基蒽醌能夠以時間和劑量依賴的方式誘導(dǎo)人卵巢癌細胞株HO-8910細胞凋亡，并且HO-8910細胞凋亡的機制涉及Fas/FasL信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Caspase-3和Caspase-8的活性亦隨著2-羥基-3-甲基蒽醌作用時間的延長而增加，而加入Caspase-3和Caspase-8的抑制劑可使HO-8910細胞的凋亡率降低，說明Fas/FasL信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在2-羥基-3-甲基蒽醌誘導(dǎo)的HO-8910細胞凋亡過程中起到了重要的作用。

本研究證實了2-羥基-3-甲基蒽醌對卵巢癌細胞株HO-8910 細胞具有體外抑制及誘導(dǎo)凋亡作用，其機制涉及死亡受體通路，為今后2-羥基-3-甲基蒽醌應(yīng)用于卵巢癌的臨床治療提供了理論依據(jù)。

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作者單位：沈陽軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)醫(yī)學(xué)研究所，沈陽 110016