劉關(guān)羽，　何衛(wèi)陽(yáng)，　朱　鑫，　楊　帆，　黃小龍，　印胡濱，　茍　欣

(1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，2分子腫瘤及表觀遺傳學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

?

氧化應(yīng)激誘導(dǎo)自噬對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與凋亡的影響*

劉關(guān)羽1, 2，何衛(wèi)陽(yáng)1△，朱鑫1，楊帆1，黃小龍1, 2，印胡濱1, 2，茍欣1

(1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，2分子腫瘤及表觀遺傳學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

[摘要]目的： 觀察氧化應(yīng)激是否可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)自噬，探索在氧化應(yīng)激微環(huán)境中自噬對(duì)MSCs增殖和凋亡的影響及可能機(jī)制，以期提高移植MSCs治療糖尿病勃起功能障礙(DMED)的效果。方法: 以過氧化氫(H2O2)模擬氧化應(yīng)激微環(huán)境。臺(tái)盼蘭染色細(xì)胞計(jì)數(shù)法及MTT分析檢測(cè)不同濃度(0 、50、100、200、400 μmol/L)H2O2對(duì)MSCs增殖的影響。聯(lián)合MTT、流式細(xì)胞術(shù)、Western blot及透射電鏡等方法研究H2O2對(duì)MSCs凋亡及自噬的影響。結(jié)果: H2O2呈濃度依耐性抑制MSCs增殖，IC50=(384.5751±16.8895)μmol/L；Western blot分析及透射電鏡提示H2O2在誘導(dǎo)MSCs凋亡的同時(shí)，誘導(dǎo)MSCs產(chǎn)生自噬；MTT分析及流式細(xì)胞術(shù)提示H2O2組細(xì)胞增殖受抑、凋亡率上升，阻斷自噬后細(xì)胞增殖進(jìn)一步減弱，凋亡率進(jìn)一步上升；Western blot結(jié)果提示H2O2誘導(dǎo)cleaved caspase-3增多及多聚ADP-核糖聚合酶1(PARP1)裂解增強(qiáng)；阻斷凋亡后，cleaved caspase-3降低及PARP1裂解減弱；阻斷自噬后，cleaved caspase-3進(jìn)一步增多及PARP1裂解進(jìn)一步增強(qiáng)。結(jié)論: 氧化應(yīng)激對(duì)MSCs存活具有雙重作用，在誘導(dǎo)MSCs凋亡的同時(shí)還誘導(dǎo)保護(hù)性自噬，阻斷MSCs自噬可以增加MSCs的凋亡，因此進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞保護(hù)性自噬將有望提高移植MSCs在糖尿病高氧化應(yīng)激微環(huán)境中的存活率，從而改善移植MSCs對(duì)糖尿病勃起功能障礙的療效。

[關(guān)鍵詞]自噬； 間充質(zhì)干細(xì)胞； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞凋亡； 氧化應(yīng)激

據(jù)報(bào)道，截至2030年，全球糖尿病患者將達(dá)3.36億，約半數(shù)糖尿病患者同時(shí)伴有勃起功能障礙(erectiledysfunction，ED)[1]。糖尿病病人患ED比非糖尿病人早10～15年，其ED嚴(yán)重程度也更高，嚴(yán)重影響著患者的家庭生活以及社會(huì)和諧[2]。在糖尿病高糖狀態(tài)下，氧化應(yīng)激微環(huán)境損害陰莖海綿體神經(jīng)和內(nèi)皮細(xì)胞，神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronalnitricoxidesynthase，nNOS)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelialnitricoxidesynthase,eNOS)活性降低，一氧化氮釋放減少，這是糖尿病勃起功能障礙(diabetesmellituserectiledysfunction，DMED)的主要發(fā)病機(jī)制之一[3]。目前治療ED的一線藥物主要是磷酸二酯酶抑制劑(phosphodiesteraseinhibitors5，PDEI5)，但其對(duì)DMED卻療效甚微[4]。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)因在具體微環(huán)境中可定向分化為陰莖海綿體血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞而被用于治療DMED的研究[5]，但前期研究表明，MSCs移植后對(duì)勃起功能改善作用持續(xù)7～28d后就逐漸消失[6-7]，推測(cè)可能與移植的MSCs無(wú)法適應(yīng)糖尿病患者陰莖海綿體內(nèi)高氧化應(yīng)激微環(huán)境而出現(xiàn)異常細(xì)胞凋亡有關(guān)[8-9]。因此，如何提高移植MSCs存活率成為亟待解決的問題。

細(xì)胞自噬是一個(gè)降解細(xì)胞內(nèi)受損蛋白及細(xì)胞器并為細(xì)胞增殖提供再利用原料的復(fù)雜過程，對(duì)MSCs自我更新、分化及存活起非常重要的調(diào)節(jié)作用[10]。一定程度的自噬對(duì)細(xì)胞存活起保護(hù)作用，但過度自噬又會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，自噬和凋亡的關(guān)系復(fù)雜，通過多個(gè)細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)相互影響[11-12]。本實(shí)驗(yàn)擬通過調(diào)節(jié)MSCs自噬水平，觀察在氧化應(yīng)激作用下自噬對(duì)MSCs增殖和凋亡的影響，為改善MSCs移植治療DMED提供理論依據(jù)。

材料和方法

1主要試劑和儀器

小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞株C3H10購(gòu)于ATCC；DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone；胎牛血清(fetalbovineserum，F(xiàn)BS)購(gòu)自Gibco；青霉素、鏈霉素購(gòu)自北京碧云天生物技術(shù)研究所；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromide，MTT]為Amresco分裝產(chǎn)品；氟聚偏乙烯(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液(enhancedchemiluminescence，ECL)購(gòu)自Millipore；預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自Thermo； 自噬抑制劑氯喹(chloroquine，CQ)、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)及微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associatedprotein1lightchain3，LC3)I抗購(gòu)自Sigma；caspase抑制劑z-VAD購(gòu)自Selleck；cleaved-caspase-3I抗購(gòu)自CST；P62及多聚ADP-核糖聚合酶1(poly-ADP-ribosepolymerase1，PARP1)I抗購(gòu)自BD；β-actinI抗購(gòu)自鐘鼎公司；II抗購(gòu)自Abgen。倒置相差顯微鏡(Olympus)；凝膠成像儀(FusionFX)；流式細(xì)胞儀(BectonDickinson)；透射顯微鏡(HITACHI)。

2主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)MSCs培養(yǎng)在含10%FBS和1%青、鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞增殖變化收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按1×104/cm2接種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)加入不同濃度(0、50、100、200、400 μmol/L)H2O2。分別向各孔加入對(duì)應(yīng)濃度H2O2，處理細(xì)胞24 h后胰酶消化下各孔細(xì)胞并用臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)。

2.3MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力的變化根據(jù)H2O2濃度不同將細(xì)胞分成 0、50、100、200、400 μmol/L 共5組；根據(jù)加入抑制劑不同，將細(xì)胞分為 對(duì)照組(常規(guī)培養(yǎng))、H2O2組、H2O2+ z-VAD組、 H2O2+3-MA組、H2O2+CQ組及H2O2+CQ+z-VAD組，共6組，其中3-MA為5 mmol/L ，CQ為10 μmol/L，z-VAD為20 μmol/L，各抑制劑均預(yù)處理細(xì)胞30 min。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MSCs，按每孔1×104接種于96孔板培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%，按上述分組加入H2O2處理細(xì)胞24h，換液，加入5g/LMTT試劑作用4h，棄上清，洗滌，再加入二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)溶解紫藍(lán)色結(jié)晶物甲瓚，于570nm處測(cè)吸光值(A)。每組設(shè)3復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，計(jì)算各組細(xì)胞活力抑制率。抑制率=(1-A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100%。

2.4Westernblot實(shí)驗(yàn)MSCs培養(yǎng)至70%～80%融合，H2O2處理細(xì)胞不同時(shí)間(針對(duì)凋亡相關(guān)蛋白cleavedcaspase-3及PARP1處理0、2、4、8h；針對(duì)自噬相關(guān)蛋白LC3、P62處理0、1、2、4、8h)后提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度后蛋白變性，按40μg/孔上樣進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白，再將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，脫脂奶粉常溫封閉1～2h，I抗4 °C過夜，洗膜，II抗常溫孵育1～2h，再洗膜，ECL發(fā)光液顯影?！白允沙薄睂?shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(常規(guī)培養(yǎng))、CQ處理細(xì)胞2.5h組、H2O2處理細(xì)胞2h組、H2O2+CQ合用藥組，其中合用藥組先用CQ預(yù)處理細(xì)胞0.5h，再加入H2O2繼續(xù)處理2h，提取細(xì)胞總蛋白檢測(cè)LC3表達(dá)變化。根據(jù)加入抑制劑不同分組如下：對(duì)照組(常規(guī)培養(yǎng))、H2O2處理細(xì)胞8h組、H2O2+z-VAD合用藥組、H2O2+CQ合用藥組、H2O2+CQ+z-VAD合用藥組，各合用藥組均先用抑制劑(z-VAD、CQ)預(yù)處理細(xì)胞0.5h，再加入H2O2繼續(xù)處理8h，提取細(xì)胞總蛋白檢測(cè)cleavedcaspase-3表達(dá)及PARP1裂解變化。以上各組中H2O2濃度均為300μmol/L，CQ均為10μmol/L，z-VAD均為20μmol/L。

2.5透射掃描電鏡檢測(cè)細(xì)胞自噬體實(shí)驗(yàn)分為正常組(常規(guī)培養(yǎng))和H2O2(300μmol/L)處理細(xì)胞 4h組。MSCs培養(yǎng)至70%～80%融合，按上述分組處理細(xì)胞后收集細(xì)胞并用PBS洗滌1～2次，離心后棄上清，加入2.5%戊二醛4 ℃固定，送樣檢驗(yàn)細(xì)胞自噬體。

2.6流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV/PI雙標(biāo)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡以下各組中H2O2濃度為300μmol/L，CQ均為10μmol/L，z-VAD均為20μmol/L。分為對(duì)照組(未做任何處理)、H2O2處理組、H2O2+z-VAD合用藥組、H2O2+CQ合用藥組、H2O2+CQ+z-VAD合用藥組，各合用藥組均先用抑制劑(z-VAD、CQ)預(yù)處理細(xì)胞 0.5h，再加入H2O2繼續(xù)處理8h。將細(xì)胞培養(yǎng)至70%～80%融合，按上述分組處理細(xì)胞后，消化收集所有培養(yǎng)液及細(xì)胞，按AnnexinV/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說明操作，1h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA)，組間兩兩比較使用Bonferroni-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1MSCs增殖抑制率隨H2O2濃度增加逐漸上升

用不同濃度(0、50、100、200、400μmol/L)H2O2處理細(xì)胞24h，臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)及MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，發(fā)現(xiàn)隨H2O2濃度的上升，MSCs增殖抑制率逐漸上升，IC50=(384.5751±16.8895)μmol/L，選擇300μmol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)濃度，見圖1。

Figure1.TheeffectsofH2O2atdifferentconcentrationsoncellviabilityandproliferationofMSCsafter24h.Mean±SD. n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖1不同濃度H2O2處理MSCs24h對(duì)其存活及增殖的影響

2H2O2在誘導(dǎo)MSCs凋亡的同時(shí)，誘導(dǎo)MSCs自噬

用H2O2(300μmol/L)處理細(xì)胞不同時(shí)間(0、2、4、8h)，Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨時(shí)間推移，cleavedcaspase-3的蛋白水平及PARP1裂解逐漸增強(qiáng)。用H2O2處理細(xì)胞不同時(shí)間(0、1、2、4、8h)發(fā)現(xiàn)，隨時(shí)間推移，LC3-Ⅱ 表達(dá)逐漸上調(diào)，P62表達(dá)逐漸下調(diào)，提示H2O2誘導(dǎo)MSCs發(fā)生自噬。為進(jìn)一步明確LC3-Ⅱ 表達(dá)上調(diào)是自噬引起而非自噬底物降解受阻造成的結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)“自噬潮”。H2O2組及CQ組LC3-Ⅱ 表達(dá)較正常組有一定程度上調(diào)；而H2O2+CQ組LC3-Ⅱ表達(dá)較H2O2組又進(jìn)一步上調(diào)，表明LC3-Ⅱ的上調(diào)是H2O2誘導(dǎo)的自噬而非自噬底物降解受阻造成的結(jié)果。透射電鏡結(jié)果顯示，與正常組對(duì)比，H2O2處理細(xì)胞4h后引起MSCs自噬體明顯增加。以上結(jié)果提示H2O2在誘導(dǎo)MSCs發(fā)生凋亡的同時(shí)誘導(dǎo)MSCs發(fā)生自噬，見圖2。

Figure2.BothapoptosisandautophagywereinducedbyH2O2.Theblackarrowindicatedtheautophagybodycontainingdigestiveendproducts.Mean±SD. n=3.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05 vsCQgroup;△P<0.05vsH2O2group.

圖2H2O2在誘導(dǎo)MSCs發(fā)生凋亡的同時(shí)，誘導(dǎo)MSCs發(fā)生自噬

3氧化應(yīng)激微環(huán)境下，MSCs發(fā)生自噬對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，H2O2組的細(xì)胞活力抑制率較正常組明顯上升，H2O2+z-VAD組的細(xì)胞活力抑制率較H2O2組明顯下降，H2O2+3-MA組和H2O2+CQ組的細(xì)胞活力抑制率較H2O2組進(jìn)一步上升，而H2O2+CQ+z-VAD組的細(xì)胞活力抑制率較H2O2+CQ組又有所下降(P<0.05)，見圖3。此外，H2o2組的細(xì)胞凋亡率較正常組明顯上升，H2O2+z-VAD組的細(xì)胞凋亡率較H2O2組明顯下降，H2O2+CQ組的細(xì)胞凋亡率較H2O2組進(jìn)一步上升，而H2O2+CQ+z-VAD組的凋亡率較H2O2+CQ組又有所下降(P<0.05)。Westernblot技術(shù)檢測(cè)cleavedcaspase-3的蛋白水平及PARP1的裂解變化顯示H2O2組cleavedcaspase-3的蛋白水平及PARP1的裂解較正常組明顯上調(diào)；H2O2+z-VAD組cleavedcaspase-3的蛋白水平及PARP1的裂解較H2O2組明顯下調(diào)，H2O2+CQ組cleavedcaspase-3的蛋白水平及PARP1的裂解較H2O2組進(jìn)一步上調(diào)，而H2O2+CQ+z-VAD組cleavedcaspase-3的蛋白水平及PARP1的裂解較H2O2+CQ組又有所下調(diào)(P<0.05)。以上均提示H2O2誘導(dǎo)MSCs發(fā)生自噬對(duì)細(xì)胞存活起保護(hù)作用，細(xì)胞死亡是通過細(xì)胞凋亡(Ⅰ型程序性死亡)途徑而非過度自噬(Ⅱ型程序性死亡)途徑發(fā)生的，見圖4。

Figure3.TheeffectsofautophagicandapoptosisblockadecombinewithH2O2onthecellactivityofMSCsfor24h.Mean±SD. n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05 vsH2O2group;△P<0.05vsH2O2+CQ group.

圖3H2O2聯(lián)合自噬及凋亡抑制劑處理MSCs24h對(duì)細(xì)胞活力的影響

討論

與非糖尿病人相比，糖尿病患者其勃起功能障礙發(fā)病更早、患病率更高、程度也更嚴(yán)重，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量[1-2]。目前治療ED的一線藥物主要是PDEI5(如：西地那非、伐地那非、他達(dá)那非等)，但這類藥物可以引起一系列不良反應(yīng)(如：頭痛、發(fā)熱、消化不良、腹瀉等)，且它對(duì)糖尿病性ED的療效遠(yuǎn)低于非糖尿病患者[4]。

干細(xì)胞具有“高度增殖、自我更新和多向分化”的特性，在特定微環(huán)境下可定向分化為陰莖海綿體血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞[5]，因此人們希望通過移植MSCs來修復(fù)受損的陰莖血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞而到達(dá)治療ED的目的。無(wú)論是功能學(xué)測(cè)定還是組織學(xué)評(píng)價(jià)都顯示干細(xì)胞移植能夠改善勃起功能，但該作用僅維持7～28d后就逐漸消失，其原因與移植的干細(xì)胞無(wú)法適應(yīng)受體的微環(huán)境而出現(xiàn)細(xì)胞過度凋亡有關(guān)[6-7]。因此，如何提高移植干細(xì)胞在受體內(nèi)的存活率，是目前ED干細(xì)胞治療亟待解決的關(guān)鍵問題。

糖尿病高血糖導(dǎo)致機(jī)體處于高氧化應(yīng)激狀態(tài)，這種狀態(tài)會(huì)損害陰莖海綿體神經(jīng)和內(nèi)皮細(xì)胞，nNOS和eNOS的活性降低，NO釋放減少，這是糖尿病ED的主要發(fā)病機(jī)制之一[3]。在鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病勃起功能障礙大鼠模型中，其陰莖海綿體內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)物如丙二醛等大量聚集，而抗氧化物質(zhì)超氧化物歧化酶和谷胱甘肽含量明顯下降，不能有效清除ROS，導(dǎo)致糖尿病ED陰莖海綿體組織中ROS水平增加[14-15]。研究顯示，即使應(yīng)用胰島素將血糖控制在正常范圍，因?yàn)榫€粒體的“代謝記憶”，即糖化的線粒體繼續(xù)產(chǎn)生過量ROS，這種高氧化應(yīng)激狀態(tài)依然存在[16]。研究表明，ROS會(huì)影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自我更新、分化，加速干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老，增加其凋亡，降低受損血管的自我修復(fù)能力[9]。

細(xì)胞自噬是一個(gè)降解細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)并為細(xì)胞增殖提供再利用原料的復(fù)雜過程，可在細(xì)胞處于內(nèi)外界壓力(如氧化壓力、低氧、營(yíng)養(yǎng)缺乏等環(huán)境)時(shí)幫助細(xì)胞度過難關(guān)，同時(shí)自噬對(duì)干細(xì)胞的自我更新及分化發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[17]。

研究表明氧化應(yīng)激在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞自噬[18]，但氧化應(yīng)激環(huán)境下自噬與凋亡的關(guān)系比較復(fù)雜，關(guān)于在糖尿病患者陰莖海綿體高氧化應(yīng)激微環(huán)境中移植MSCs是否發(fā)生自噬、自噬與細(xì)胞存活及凋亡的關(guān)系，目前國(guó)內(nèi)外尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)用H2O2模擬高氧化應(yīng)激微環(huán)境，探討體外MSCs在高氧化應(yīng)激環(huán)境中凋亡及自噬水平的變化，并通過調(diào)節(jié)MSCs自噬水平，觀察其在氧化應(yīng)激微環(huán)境下對(duì)MSCs增殖和凋亡的影響。首先，臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)法及MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)得細(xì)胞增殖率隨H2O2濃度上升逐漸下降。以酶原形式存在于胞漿中的caspase-3被激活生成活性片段cleavedcaspase-3以及PARP1 裂解被看作是細(xì)胞發(fā)生凋亡的標(biāo)志之一。LC3存在胞漿可溶型LC3-Ⅰ和膜結(jié)合型LC3-Ⅱ 2種形式，當(dāng)自噬被激活時(shí)，LC3-Ⅱ 隨自噬體膜的增多而增多，是自噬體的標(biāo)志分子，因此LC3-Ⅱ 表達(dá)上調(diào)可作為細(xì)胞發(fā)生自噬的標(biāo)志之一。P62是一個(gè)泛素結(jié)合蛋白，參與自噬過程并被降解，其表達(dá)下調(diào)可反映自噬活性增強(qiáng)[13]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨時(shí)間推移，LC3-Ⅱ、cleavedcaspase-3和cleavedPARP1的蛋白水平逐漸上調(diào)而P62逐漸下調(diào)，說明氧化應(yīng)激微環(huán)境下細(xì)胞在發(fā)生凋亡的同時(shí)誘導(dǎo)自噬?！白允沙薄奔巴干潆娮语@微鏡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)MSCs發(fā)生自噬。為探討在氧化應(yīng)激微環(huán)境下細(xì)胞發(fā)生的自噬與凋亡的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合MTT及流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)H2O2抑制細(xì)胞增殖，增加細(xì)胞凋亡；阻斷自噬后細(xì)胞增殖進(jìn)一步受抑制，凋亡率進(jìn)一步上升，而凋亡抑制劑z-VAD能反轉(zhuǎn)這一結(jié)果。

Figure4.TheprotectiveeffectsofautophagyinducedbyH2O2ontheMSCs.Mean±SD. n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05 vsH2O2group;△P<0.05vsH2O2+CQ group.

圖4H2O2誘導(dǎo)MSCs自噬對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用

Westernblot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，H2O2能增加凋亡相關(guān)蛋白cleavedcaspase-3及cleavedPARP1的水平；阻斷自噬后，cleavedcaspase-3及cleavedPARP1進(jìn)一步上調(diào)；而阻斷凋亡后，cleavedcaspase-3及cleavedPARP1明顯下調(diào)。以上結(jié)果均提示氧化應(yīng)激引起MSCs死亡是通過凋亡途徑而非過渡自噬途徑實(shí)現(xiàn)的，其誘導(dǎo)的自噬對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用，但氧化應(yīng)激誘導(dǎo)MSCs發(fā)生自噬的具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步探索。

綜上所述，氧化應(yīng)激對(duì)MSCs存活具有雙重作用，在促進(jìn)MSCs凋亡的同時(shí)還誘導(dǎo)保護(hù)性自噬，阻斷MSCs自噬可以顯著增加MSCs凋亡，因此進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞保護(hù)性自噬可能有望提高移植MSCs在糖尿病高氧化應(yīng)激微環(huán)境的存活率，從而改善移植MSCs對(duì)糖尿病勃起功能障礙的療效。本實(shí)驗(yàn)的成功實(shí)施，將為移植MSCs治療DMED提供新的思路。

[參考文獻(xiàn)]

[1]PhéV,RouprêtM.Erectiledysfunctionanddiabetes:Areviewofthecurrentevidence-basedmedicineandasynthesisofthemainavailabletherapies[J].DiabetesMetab, 2012, 38(1):1-13.

[2]MariaMI,BellastellaG,EspositoK.Diabetesandsexualdysfunction:currentperspectives[J].DiabetesMetabSyndrObes, 2014, 7:95-105.

[3]BurnettAL,LowensteinCJ,BredtDS,etal.Nitricoxide:aphysiologicmediatorofpenileerection[J].Science,1992, 257(5608):401-403.

[4]MalavigeLS,LewJC.Erectiledysfunctionindiabetesmellitus[J].JSexMed, 2009, 6(5):1232-1247.

[5]AlwaalA,ZaidUB,LinCS,etal.Stemcelltreatmentoferectiledysfunction[J].AdvDrugDelivRev, 2014, 21(12):1280-1285.

[6]FandelTM,AlbersenM,LiuG,etal.Recruitmentofintracavernouslyinjectedadipose-derivedstemcellstothemajorpelvicganglionimproveserectilefunctioninaratmodelofcavernousnerveinjury[J].EurUrol, 2012, 61(1): 201-210.

[7]GouX,HeWY,XiaoMZ,etal.TransplantationofendothelialprogenitorcellstransfectedwithVEGF165torestoreerectilefunctionindiabeticrats[J].AsianJAndrol, 2011,13(2):332-338.

[8]MottaqhiS,LarijaniB,SharifiAM.Apelin13:anovelapproachtoenhanceefficacyofhypoxicpreconditionedmesenchymalstemcellsforcelltherapyofdiabetes[J].MedHypotheses, 2012, 79(6):717-718.

[9]YaoEH,YuY,FukudaN.Oxidativestressonprogenitorandstemcellsincardiovasculardiseases[J].CurrPharmBiotechnol, 2006, 7(2):101-108.

[10]MortensenM,WatsonAS,SimonAK.Lackofautophagyinthehematopoieticsystemleadstolossofhematopoieticstemcellfunctionanddysregulatedmyeloidproliferation[J].Autophagy, 2011, 7(9):1069-1070.

[11]ChenW,SunY,LiuK,etal.Autophagy:adouble-edgedswordforneuronalsurvivalaftercerebralischemia[J].NeuralRegenRes, 2014, 9(12):1210-1216.

[12]胡鵬飛，賴東武，何紅. 自噬在晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用[J]. 中國(guó)病理生理雜志，2012, 28(6):1006-1011.

[13]秦正紅, 樂衛(wèi)東.《自噬——生物學(xué)與疾病》[M]. 第1版. 北京：科學(xué)出版社，2011：55-57.

[14]LongT,LiuG,WangY,etal.TNF-α,erectiledysfunction,andNADPHoxidase-mediatedROSgenerationincorpuscavernosuminhigh-fatdiet/streptozotocin-induceddiabeticrats[J].JSexMed, 2012, 9(7):1801-1814.

[15]LiM,ZhuanL,WangT,etal.ApocyninimproveserectilefunctionindiabeticratsthroughregulationofNADPHoxidaseexpression[J].JSexMed, 2012, 9(12):3041-3050.

[16]IhnatMA,ThorpeJE,KamatCD,etal.Reactiveoxygenspeciesmediateacellular“memory”ofhighglucosestresssignalling[J].Diabetologia, 2007, 50(7):1523-1531.

[17]GuanJL,SimonAK,PrescottM,etal.Autophagyinstemcells[J].Autophagy, 2013, 9(6):830-849.

[18]KaminskyyVO,ZhivotovskyB.Freeradicalsincrosstalkbetweenautophagyandapoptosis[J].AntioxidRedoxSignal, 2014, 21(1):86-102.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 余小慧)

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81200254)；山西省回國(guó)留學(xué)人員科研基金資助項(xiàng)目(No. 2014-033)；山西省研究生創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(No. 20133075)

Effectofoxidativestress-inducedautophagyonproliferationandapoptosisofMSCsLIUGuan-yu1, 2,HEWei-yang1, ZHU Xin1,YANGFan1, HUANG Xiao-long1, 2, YIN Hu-bin1, 2, GOU Xin1

(1DepartmentofUrinarySurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,2Chongqing Key Laboratory of Molecular Oncology and Epigenetics, Chongqing 400016, China. E-mail: gouxincq@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate whether oxidative stress is able to induce autophagy in mesenchymal stem cells (MSCs), and to explore the effects of autophagy on MSC proliferation and apoptosis under oxidative stress circumstance as well as the underlying mechanism for promoting the therapeutic effects of transplanted MSCs on treating diabetes mellitus erectile dysfunction (DMED). METHODS: Hydrogen peroxide (H2O2) was applied to simulate the oxidative stress circumstance. The effects of H2O2at concentration of 0, 50, 100, 200, 400 μmol/L on the viability of MSCs were tested by the method of Trypan blue exclusion and MTT assay respectively . The methods of MTT assay, Western blot and transmission electron microscope (TEM) were used to explore the effects of H2O2on MSC apoptosis and autophagy. RESULTS: The proliferation of MSCs was obviously inhibited by H2O2in a dose-dependent manner (P<0.01) and the 50% inhibiting concentration (IC50) was (384.58±16.89) μmol/L. H2O2induced apoptosis and autophay of MSCs. The proliferation rate of MSCs was suppressed by H2O2significantly (P<0.05), with a further decline by blockade of autophagy (P<0.05) whereas increased by blockade of apoptosis (P<0.05). H2O2induced MSCs apoptosis obviously (P<0.05), with an augment of apoptosis (P<0.05) by blockade of autophagy. Furthermore, the H2O2increased expression of cleaved caspase-3 and cleavage of poly ADP-ribose polymerase 1 (PARP1), Which were decreased by apoptosis blockade whereas were enhanced by blockade of autopahgy. CONCLUSION: Oxidative stress plays a dual role in MSC survival, which induces MSC apoptosis and autophagy. Moreover, blockade of autophagy intensifies MSC apoptosis. Therefore, it is a promising method to ameliorate the effects of stem-cell based therapy on DMED by enhancing protective autophagy to increase the survival rate of transplanted MSCs against oxidative stress circumstance caused by diabetes mellitus.

[KEY WORDS]Autophagy; Mesenchymal stem cells; Cell proliferation; Apoptosis; Oxidative stress

通訊作者△Tel: 0351-4135787; E-mail: luli7300@126.com

[收稿日期]2015- 04- 30[修回日期] 2015- 09- 07

[文章編號(hào)]1000- 4718(2015)12- 2183- 05

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.011

[中圖分類號(hào)]R363.2; R698+.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A