陳雪姣，趙偉鋒，溫一陽，王朝杰，付　蕾，胡金龍，白　冰，倉順東

(鄭州大學(xué)附屬人民醫(yī)院,河南 鄭州 450003)

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肝癌組織中SRC-3的表達(dá)及其與肝癌臨床病理特征的關(guān)系

陳雪姣，趙偉鋒，溫一陽，王朝杰，付蕾，胡金龍，白冰，倉順東

(鄭州大學(xué)附屬人民醫(yī)院,河南 鄭州 450003)

[摘要]目的探討肝癌組織中類固醇受體共激活因子-3(SRC-3)表達(dá)及其與肝癌臨床病理特征的關(guān)系。方法采用免疫組織化學(xué)染色和RT-PCR檢測80例肝癌組織和癌旁組織中SRC-3蛋白和mRNA表達(dá)水平。結(jié)果肝癌組織中SRC-3蛋白陽性表達(dá)率為56.25%，明顯高于癌旁組織的8.75%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。58例肝癌組織中SRC-3 mRNA呈高水平轉(zhuǎn)錄，癌旁組織僅有12例出現(xiàn)高水平轉(zhuǎn)錄，肝癌組織中SRC-3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平較癌旁組織明顯升高(P<0.05)。合并乙型肝炎病毒(HBV)感染肝癌患者SRC-3蛋白表達(dá)陽性率為63.49%，明顯高于未合并HBV感染肝癌患者的29.41%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；甲胎蛋白(AFP)<400 ng·mL-1肝癌患者SRC-3蛋白表達(dá)陽性率為76.19%，明顯高于AFP≥400 ng·mL-1肝癌患者的49.15%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高分化肝癌患者SRC-3蛋白表達(dá)陽性率為 88.24%，明顯高于中、低分化患者的47.62%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論SRC-3的高表達(dá)與肝癌的疾病進(jìn)展關(guān)系密切，可能成為潛在的肝癌分子標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞]肝癌；類固醇受體共激活因子-3；免疫組織化學(xué)染色；RT-PCR

近年來，新增肝癌病例逐年增多，其早期癥狀輕微，不易被診斷并及時(shí)治療，故患者被確診時(shí)多處于中晚期，部分甚至出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的癥狀[1]，導(dǎo)致其治療難度較大，同時(shí)患者預(yù)后性較差，死亡率極高，故準(zhǔn)確查明肝癌的發(fā)病機(jī)制以提高其早期診斷的準(zhǔn)確性，已成為延長患者生存時(shí)間的關(guān)鍵點(diǎn)[2]。類固醇受體共激活因子-3(steroid receptor coactivator -3，SRC-3)作為新發(fā)現(xiàn)的一種原癌基因，其蛋白編碼類似固醇激素受體，具有激活轉(zhuǎn)錄細(xì)胞染色體片段的功能，若其在人體內(nèi)過表達(dá)可導(dǎo)阻斷或影響多種信號(hào)通路[3]，從而刺激或抑制腫瘤生成。本研究采用免疫組織化學(xué)染色和RT-PCR檢測2013年5月至2015年5月在我院治療的80例肝癌患者的肝癌組織和癌旁組織中SRC-3蛋白和mRNA表達(dá)水平，以探討SRC-3表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1研究對(duì)象選取2013年5月至2015年5月在我院治療的肝癌患者80例，納入標(biāo)準(zhǔn)[4]：1)均為行肝癌切除術(shù)患者；2)手術(shù)前未進(jìn)行過放療、化療、介入等治療；2)術(shù)后病理檢查證實(shí)為肝細(xì)胞肝癌；4)患者及家屬知情同意，并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者臨床病理資料缺失；術(shù)前行過放療、化療、介入治療。80例肝癌患者中，男57例，女23例；年齡32～73(53.19±12.40)歲。本次研究通過了院內(nèi)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2標(biāo)本采集納入研究的80例肝癌患者手術(shù)切除后均獲取的新鮮組織標(biāo)本，送檢經(jīng)術(shù)后病理檢查確診為肝細(xì)胞肝癌。標(biāo)本獲取即可放于液氮標(biāo)本罐中，并冷存于-80 ℃低溫冰箱中，后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，HE染色。

1.3儀器和試劑NCOA3多克隆抗體購自上海研晶實(shí)業(yè)科技有限公司；生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗購自上海研卉生物科技有限公司；RNA Trizol、PrimeScript RT reagent逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及2×Taq PCR Mastennix均購自日本TAKARA(大連)公司；凝膠成像分析系統(tǒng)購自上海志行儀器設(shè)備有限公司；醫(yī)用冰箱購自安徽中科都菱商用電器股份有限公司。

1.4SRC-3引物設(shè)計(jì)按照SRC-3的cDNA序列排列，使用Primer 3.0軟件對(duì)PCR引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，序列如下：P1(上游引物)：5’-TCTGGG-GACTAAGCAACAGG-3’，P2(下游引物)：5’-AGTCACATTTCG-GTTTGGCC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為262 bp。以β-actin基因表達(dá)產(chǎn)物作為內(nèi)參照設(shè)計(jì)PCR引物，序列如下：P1：5’-CCTGGCACCCAGCACAAT-3’：P2：5’-GGGCCGGACTCGTCATACT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為143 bp，由美國Invitmgen公司合成。

1.5SRC-3蛋白檢測肝癌組織及癌旁組織中SRC-3蛋白檢測采用免疫組織化學(xué)S-P法。肝癌組織及癌旁組織切片置于65 ℃烤箱中加溫30 min，后逐步脫蠟及水化，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)3% H2O2除去內(nèi)源性過氧化物酶，接著放入室溫條件下孵育10~15 min，使用PBS沖洗1次，加入0.01 moL·L-1的檸檬酸PBS緩沖液緩慢加溫至95~98 ℃攪拌修復(fù)20 min，然后放于室溫條件下慢慢冷卻，選擇PBS沖洗，再加入體積分?jǐn)?shù)5%山羊血清后封閉置于37 ℃靜置20 min，加入兔抗人SRC-3抗體放入4 ℃孵育箱靜置過夜，取出放入37 ℃條件下解凍30 min，PBS沖洗后滴加羊抗兔二抗，于37 ℃孵育20 min，行PBS沖洗并滴入鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物，置于37 ℃條件下孵育20 min，PBS沖洗后滴加DAB顯色，在顯微鏡觀察下控制染色試劑反應(yīng)時(shí)間，達(dá)到理想染色時(shí)即刻用蒸餾水沖洗以終止反應(yīng)，后行蘇木素復(fù)染，脫水、透明，最后用中性樹膠封固。

1.6SRC-3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平檢測RT-PCR法檢測SRC-3 mRNA轉(zhuǎn)錄：取100 mg肝癌組織及癌旁組織后用Trizol法常規(guī)提取總RNA，后用分光光度計(jì)檢測定量后，抽取2 μg總RNA，按照試劑盒操作說明對(duì)cDNA行逆轉(zhuǎn)錄合成。以β-actin作為內(nèi)參，對(duì)半定量PCR行擴(kuò)增。條件為：94 ℃溫度下，預(yù)變性5 min，變性30 s，55 ℃溫度下退火30 s，72 ℃溫度下延伸30 s，行循環(huán)30次，72 ℃溫度下延伸5 min。反應(yīng)得到PCR產(chǎn)物放入4 ℃冰箱下冷存，后取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，DAB染色后加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min，后取反應(yīng)物在凝膠成像儀下觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果。

1.7免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷免疫組織化學(xué)染色陽性為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)淡黃至棕褐色顆粒。采用二級(jí)計(jì)分法，將陽性著色細(xì)胞占視野內(nèi)細(xì)胞百分比和細(xì)胞著色強(qiáng)度得分結(jié)合計(jì)算[6]。陽性細(xì)胞≤10%為0分，11%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。細(xì)胞著色強(qiáng)度[7]：棕褐色為3分，棕黃色為2分，淡黃色為1分，不著色為0分。陽性細(xì)胞百分比得分和細(xì)胞著色強(qiáng)度得分乘積，≤1分為陰性，>1分為陽性。

2結(jié)果

2.1SRC-3蛋白在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)SRC-3蛋白陽性染色主要表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色顆粒，分布呈彌漫或局灶狀(圖1)。肝癌組織中SRC-3蛋白陽性表達(dá)率為56.25%，明顯高于癌旁組織的 8.75%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1　SRC-3蛋白在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

圖1　SRC-3 在肝癌組織(A)和癌旁組織(B)中的表達(dá)情況(S-P，×400)

2.2SRC-3 mRNA在肝癌組織和癌旁組織中的轉(zhuǎn)錄水平58例肝癌組織中SRC-3 mRNA呈高水平轉(zhuǎn)錄，癌旁組織僅有12例出現(xiàn)高水平轉(zhuǎn)錄，肝癌組織中SRC-3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平較癌旁組織明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2　SRC-3 mRNA在肝癌組織和癌旁組織中的轉(zhuǎn)錄水平

2.3SRC-3蛋白表達(dá)與其臨床病理特征的關(guān)系合并乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染肝癌患者SRC-3蛋白表達(dá)陽性率為63.49%，明顯高于未合并HBV感染肝癌患者的29.41%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)<400 ng·mL-1肝癌患者SRC-3蛋白表達(dá)陽性率為 76.19%，明顯高于AFP≥400 ng·mL-1肝癌患者的49.15%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高分化肝癌患者SRC-3蛋白表達(dá)陽性率為88.24%，明顯高于中、低分化患者的47.62%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3　SRC-3蛋白表達(dá)與其臨床病理特征的關(guān)系

3討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已證明，肝癌的形成過程漫長且極其復(fù)雜，其可能因機(jī)體內(nèi)肝臟組織細(xì)胞增殖及生長的調(diào)控過程出現(xiàn)異常所致[8]。人體內(nèi)各種細(xì)胞包括肝組織細(xì)胞增殖由受多種調(diào)節(jié)因子調(diào)控，其中包括生長因子及其受體、基因轉(zhuǎn)錄因子、各類信號(hào)傳導(dǎo)蛋白及增殖-凋亡調(diào)控蛋白酶等，這些因子均可顯著影響腫瘤生成及生長，并有效促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡[9]。近年來，有學(xué)者在研究乳腺癌致病機(jī)制的過程中，新發(fā)現(xiàn)一種核激素受體轉(zhuǎn)錄共激活因子SRC-3，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明其與乳腺癌腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄擴(kuò)展具有密切關(guān)系[10]。研究[11]顯示，SRC-3能夠與細(xì)胞核受體、核因子кB(NF-кB)、激活蛋白-1(AP-1)和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶及甲基轉(zhuǎn)移酶等人體因子或蛋白結(jié)合、相互作用，使得細(xì)胞內(nèi)染色體得到重建，并促進(jìn)靶基因轉(zhuǎn)錄。SRC-3能夠有效促進(jìn)細(xì)胞的生長及增殖，還可顯著調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要的作用，同時(shí)人體細(xì)胞內(nèi)SRC-3表達(dá)水平及活性的改變會(huì)導(dǎo)致相關(guān)細(xì)胞因子呈現(xiàn)連鎖式異變，從而造成整個(gè)細(xì)胞出現(xiàn)變異或癌變化。

在本研究中，通過免疫組織化學(xué)染色檢測肝癌組織及癌旁組織標(biāo)本中SRC-3的表達(dá)，我們可以觀察到SRC-3蛋白陽性染色表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色顆粒，染色結(jié)果顯示肝癌組織中SRC-3蛋白陽性表達(dá)率為56.25%，而癌旁組織中SRC-3蛋白陽性表達(dá)率明顯要低，僅為8.75%。結(jié)果顯示，肝癌組織中SRC-3呈現(xiàn)異常性高表達(dá)。同時(shí)，我們觀察染色后的標(biāo)本，可見SRC-3染色呈彌漫或局灶狀分布，肝癌組織染色顆粒較集中，而癌旁組織染色顆粒分散。故我們可推測SRC-3和肝細(xì)胞的合成、增殖、凋亡及代謝信號(hào)傳導(dǎo)等生理活動(dòng)具有一定相關(guān)性，若其表達(dá)異?？蓪?dǎo)致肝細(xì)胞異變成肝癌細(xì)胞。

SRC-3 mRNA水平在乳腺癌組織內(nèi)及子宮內(nèi)膜癌組織內(nèi)的表達(dá)水平明顯高于正常乳腺及子宮內(nèi)膜組織。本研究結(jié)果顯示，肝癌組織中SRC-3 mRNA呈高水平轉(zhuǎn)錄的標(biāo)本數(shù)量明顯高于癌旁組織，同時(shí)肝癌組織中SRC-3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平較癌旁組織明顯升高?，F(xiàn)代臨床研究[12]證實(shí)，慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎患者均是肝癌的高發(fā)群體，這是因?yàn)楦窝撞《緩?fù)制與肝癌產(chǎn)生機(jī)制間具有明顯相關(guān)性，HBV繼發(fā)肝硬化后進(jìn)一步導(dǎo)致肝癌概率最高，據(jù)統(tǒng)計(jì)，約70%~90%的慢性乙型肝炎患者在肝硬化后均出現(xiàn)肝癌。同時(shí)，HBV可促使細(xì)胞染色體的融合，并可反式激活細(xì)胞基因，提高細(xì)胞內(nèi)SRC-3表達(dá)后呈現(xiàn)高水平轉(zhuǎn)錄，并和NF-κB相互作用，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄異變后插入肝組織細(xì)胞主基因序列段內(nèi)，導(dǎo)致其RNA轉(zhuǎn)錄異變，促使細(xì)胞癌變。故在研究中，合并HBV感染肝癌患者SRC-3蛋白表達(dá)陽性率明顯高于未合并HBV感染肝癌患者。同時(shí)，在本研究中，我們還發(fā)現(xiàn)AFP<400 ng·mL-1肝癌患者SRC-3蛋白表達(dá)陽性率明顯高于AFP≥400 ng·mL-1肝癌患者，這是因?yàn)楦伟┠[瘤患者可致體內(nèi)AFP水平呈現(xiàn)高表達(dá)，其已作為常規(guī)篩選肝癌患者檢測標(biāo)志物。其于正常人體內(nèi)的濃度標(biāo)準(zhǔn)約為20 ng·mL-1，高表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)為400 ng·mL-1，其代表患者肝癌直徑較大且已彌散至不同的肝葉上。同時(shí)，研究中高分化肝癌患者SRC-3蛋白表達(dá)陽性率也明顯高于中、低分化患者。因此，我們推斷肝癌患者腫瘤分期及分化程度越高，其肝組織內(nèi)SRC-3水平越高，故我們認(rèn)為SRC-3表達(dá)水平還可預(yù)測患者預(yù)后及未來存活率。

綜上所述，SRC-3表達(dá)水平變化與肝癌患者臨床病理特征具有一定相關(guān)性，能夠被作為一種潛在的肝癌分子標(biāo)志物用于未來肝癌治療的新靶點(diǎn)。

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SRC-3 Expression in the Hepatocellular

Carcinoma and Its Relationship with Clinicopathological Features

Chen Xuejiao,Zhao Weifeng,Wen Yiyang,Wang Zhaojie,Fu Lei,Hu Jinlong,Bai Bing,Cang Shundong

(DepartmentofOncology,thePeople’sHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity,Zhengzhou450003,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the expression of steroid receptor coactivator-3(SRC-3)in the hepatocellular carcinoma tissues and its relationship with clinicopathological features.Methodsimmunohistochemical staining and RT-PCR were used to detect SRC-3 protein and mRNA expression levels in the 80 cases of hepatocellular carcinoma and paraneoplastic tissues.ResultsThe positive expression rate of SRC-3 protein in hepatocellular carcinoma tissues was 56.25%,which was significantly higher than that(8.75%)in the paraneoplastic tissues(P<0.05).SRC-3 mRNA was high level transcription in the 58 cases of hepatocellular carcinoma,and was 12 cases in the paraneoplastic tissues,SRC-3 mRNA transcription level in the hepatocellular carcinoma was significantly increased than the paraneoplastic tissue(P<0.05).The positive rate of SRC-3 protein expression in the patients with hepatitis B virus (HBV) infection was 63.49%,which was significantly higher than that(29.41%)of patients with non HBV infection,the difference was statistically significant(P<0.05); the positive rate of SRC-3 protein expression in the patients with alpha-fetoprotein (AFP) <400 ng·mL-1was 76.19%,significantly higher than that(49.15%)in the patients with AFP≥400 ng·mL-1,the difference was statistically significant(P<0.05); the positive rate of SRC-3 protein expression in the patients with high differentiated hepatocellular carcinoma was 88.24%,significantly higher than that(47.62%)in the patients with inmiddle and low differentiated hepatocellular carcinoma,the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionSRC-3 high expression is related with the canceration and progression of hepatocellular carcinoma,and may become a potential molecular marker or therapeutic target.

[Key words]hepatocellular carcinoma; steroid receptor coactivator-3; immunohistochemical staining; RT-PCR

收稿日期：(2015-06-13)

[中圖分類號(hào)]R735.7；R730.23

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1673-5412(2015)06-0469-05

通信作者：趙偉鋒(1986-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤靶向治療分子機(jī)制研究。E-mail：292965288@qq.com

作者簡介：陳雪姣(1987-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事胸部、胃腸道及血液系統(tǒng)惡性腫瘤的基礎(chǔ)研究和臨床工作。E-mail：chenxuejiao9999@163.com

DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2015.06.003