于玖軒　徐曉陽　雷霜霜　陳澤良　王季秋　王大力　鄭源強　石艷春

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學自治區(qū)分子生物學重點實驗室，呼和浩特010058)

布病患者血清microRNA-146a表達及其與抗體滴度的關(guān)系研究①

于玖軒徐曉陽②雷霜霜②陳澤良②王季秋③王大力③鄭源強石艷春

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學自治區(qū)分子生物學重點實驗室，呼和浩特010058)

①本文為國家“十二五”科技支撐計劃項目(2014BAI13B03)、國家自然科學基金項目(81171530、31272592、81401646、81460248、81260457)、內(nèi)蒙古自治區(qū)科技重大專項、內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學基金(2013MS1138、2012MS1121、2015MS0820)、內(nèi)蒙古自治區(qū)科技計劃項目(20120101、20120402、20110501)、內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)計委醫(yī)療衛(wèi)生科研計劃項目(201301035、2010018)、內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學校科學研究項目(NJZY109)資助。

②軍事醫(yī)學科學院疾病預(yù)防控制所，北京100071。

③中國疾病預(yù)防控制中心鼠疫布病防治基地，白城137000。

石艷春(1958年-)，女，博士，教授，主要從事抗感染免疫與疫苗研究，E-mail:ycshi5388@163.com。

[摘要]目的：研究microRNA-146a在布病患者血清中表達規(guī)律及其與血清滴度的關(guān)系。方法：采用定量PCR方法，測定布病患者和健康人血清中miR-146a的表達，并分析表達水平與血清抗體水平、就診時間等彼此的相關(guān)性。結(jié)果：利用陽性參考品建立了miR-146a定量檢測工作曲線，對20例布病陽性病例和20例正常人血清miR-146a進行了檢測，布病患者血清中miR-146a顯著低于正常人(P<0.001)，miR-146a的水平與血清抗體滴度呈負相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論：布魯氏菌感染后患者血清中miR-146a表達被抑制，并且患者血清抗體滴度越高，抑制程度越高。

[關(guān)鍵詞]microRNA-146a；布??；血清抗體滴度

布魯氏菌病(Brucellosis，簡稱布病)是由布氏菌入侵機體引起的全球廣泛流行的人畜共患病。近年來布病在全球的發(fā)病率有上升趨勢，部分國家和地區(qū)的發(fā)病率超過萬分之一，已被確定為再發(fā)性傳染病[1]。布病的傳播方式主要是人類通過接觸受感染的動物、攝入未經(jīng)高溫消毒的奶制品以及食用受感染牲畜的肉制品等[2]。

動物布病主要表現(xiàn)為流產(chǎn)和附睪炎，人類感染布氏菌可出現(xiàn)典型的臨床表現(xiàn)如發(fā)熱、出汗、寒戰(zhàn)、頭痛、不適、肌痛和關(guān)節(jié)痛[3]。布病按疾病階段可分為急性、亞急性、慢性；按疾病的表現(xiàn)分為復(fù)發(fā)、活躍及不活躍。上世紀90年代以來，我國布病的發(fā)病率呈明顯上升趨勢。布病的發(fā)病特點是一旦發(fā)病并轉(zhuǎn)入慢性就難以根治，臨床治療上使用抗生素的方法也常失效或?qū)е聫?fù)發(fā)，嚴重威脅著人民群眾的生命健康與安全，已成為一個重要的公共安全衛(wèi)生問題。了解布病的致病與免疫機制，對于預(yù)防該病具有重要意義。

MicroRNA(miRNA)是一種存在于動植物體內(nèi)，長度為18~22nt的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，主要在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達進行調(diào)節(jié)。在人類基因組中，miRNA占所有基因的 1%~5%，但卻能夠調(diào)節(jié)30%蛋白編碼基因的表達[4]，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。近年來研究者已證實miRNA在宿主和細菌之間起到重要的關(guān)聯(lián)作用[5]。其中miRNA-146a(miR-146a)是首個被發(fā)現(xiàn)具有免疫調(diào)節(jié)作用的miRNA，廣泛參與了多種炎癥及自身免疫性疾病等免疫反應(yīng)相關(guān)疾病的發(fā)生過程[6,7]。但是，miR-146a在人布病中的具體表達變化及其臨床病理意義尚不清楚。本研究旨在研究miR-146a在布病患者體內(nèi)表達規(guī)律，為探尋布病發(fā)病機理及針對性治療提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1資料與試劑于2015年5月~2015年6月期間在布病門診收集的布病患者全血和血清樣本。對照組為健康體檢者。通用探針法定量PCR引物包括：Uni-RT逆轉(zhuǎn)錄引物(5′-CAG TGC AGG GTC CGA GGT CAG AGC CAC CTG GGC AAT TTT TTT TTT TVN-3′)、Uni-R(5′-CAG TGC AGG GTC CGA GGT-3′)、Uni-P(5′-FAM CAG AGC CAC CTG GGC AAT T BHQ-3′)。TaKaRa Taq(rTaq DNA Polymer-ase)、探針法定量PCR試劑盒購自寶生生物工程(大連)有限公司；Trizol Reagent購自美國Ambion公司；人miR-146a上游引物(5′-TGA GAA CTG AAT TCC ATG GGT T-3′)購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；人工合成的人miR-146a模擬物(5′-UGA GAA CUG AAU UCC AUG GGUU-3′)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2方法

1.2.1總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄將全血樣本室溫7 340 r/min離心3 min，取上層血漿使用Trizol法提取總RNA：加入1 ml Trizol試劑，振蕩器充分振蕩，置10 min。加入約200 μl的三氯甲烷，上下顛倒充分混勻1 min左右，室溫靜置5 min。4℃,11 372 r/min離心30 min，取水相轉(zhuǎn)入新的1.5 ml 離心管，加入等體積的異丙醇顛倒混勻，4℃放置1 h。取出后將樣本4℃，11 372 r/min離心30 min去上清，向沉淀中加入1 ml 75%乙醇，4℃，11 372 r/min離心洗滌沉淀10 min，重復(fù)3遍。去上清，沉淀室溫晾干后加入DEPC水充分溶解。測RNA濃度，測定OD260/OD280值。逆轉(zhuǎn)錄過程嚴格按照miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說明書實施。將合成的cDNA置于-20℃保存。

1.2.2qRT-PCR體系及反應(yīng)參數(shù)TaKaRa rTaq DNA Polymerase 0.2 μl，10×PCR Buffer 1 μl ，dNTP Mixture 0.8 μl，cDNA 0.2 μl，上游引物0.2 μl，下游引物 0.2 μl，探針0.2 μl，RNase free H2O 7.2 μl。按如下條件進行PCR反應(yīng)：預(yù)變性95℃ 2 min，變性95℃ 10 s，退火延伸60℃ 30 s，擴增40個循環(huán)。每個樣本獨立重復(fù)實驗 3 次。

1.2.3microRNA-146a標準曲線的建立將工作濃度20 μmol/L的人microRNA-146a模擬物作為標準品，測定OD 值，按miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒將得到的已知濃度RNA標準品進行逆轉(zhuǎn)錄，之后將 cDNA 進行10倍系列稀釋，作為模板進行Real-time PCR擴增，根據(jù)擴增Ct值及其標準品含量，制備定量標準曲線。

1.3統(tǒng)計學方法采用 SPSS17.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用 One-way ANOVA 和Independent Samples Test檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1miR-146a定量工作曲線的建立根據(jù)通用探針法的原理，將已知濃度的microRNA-146a標準品按miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒進行Poly(A)修飾反應(yīng)后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后系列稀釋，用miR-146a特異的上游、通用下游引物和探針進行擴增，根據(jù)擴增Ct值與標準品的原始濃度，建立定量標準曲線(圖1A)。系列稀釋梯度的cDNA擴增曲線(圖1B)所示， miR-146a cDNA擴增按濃度遞減呈梯度遞減，而水沒有擴增。根據(jù)擴增結(jié)果建立的標準曲線如圖1A所示。建立的標準曲線相關(guān)系數(shù)大于0.99，在濃度范圍2 ng~20 μg之間具有較好的線性關(guān)系，可以用于后續(xù)樣品的檢測。

2.2病例與對照組人口特征從布病門診收集布病患者20人，平均年齡48.75歲，男性14人占70%，女性6人占30%，血清抗體滴度1∶50的8人，1∶100滴度6人，1∶200滴度6人；對照組人員20人，平均年齡46.70歲，其中男性13人占到 65%，女性7人占35%。由整理信息發(fā)現(xiàn)，布病的患病人群年齡集中在44~54歲之間。臨床癥狀多有發(fā)熱、關(guān)節(jié)痛等(表1)。

表1人口特征信息

Tab.1Demographic characteristics

2.3布病組與對照組miR-146a的表達差異從患者和正常人血漿中提取RNA，Poly(A)修飾反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄后進行擴增。布病患者血清中microRNA-146a的平均濃度為0.71 μmol/L(范圍0.04~1.58 μmol/L)，而正常健康人的濃度平均為6.75 μmol/L(范圍0.18~22.53 μmol/L)。統(tǒng)計分析顯示，布病患者血漿中的濃度顯著低于正常人(圖2，P<0.001)。

2.4miR-146a表達水平與血清抗體滴度的關(guān)系依據(jù)患者入院血清抗體滴度(Serum antibody titer,SAT)檢查資料，按照不同的血清抗體滴度分為1∶50、1∶100和1∶200三組，如圖3所示，三組之間差異顯著，并且SAT滴度越高，miR-146a含量則越低(P<0.05)。

2.5miR-146a表達與臨床特征間的相關(guān)性關(guān)系按患者入院登記發(fā)病至確診時間，分為<10 d、10~20 d、>20 d三個組，比較3組之間miR-146a的濃度差異，從圖4上可以看出，盡管均值之間有差異，但由于組內(nèi)個體之間表達量差異較大，按時間分的組之間沒有統(tǒng)計學差異。將miRNA-146a的濃度與臨床癥狀做相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)熱、乏力、關(guān)節(jié)痛和腰背痛癥狀的患者與正常人miR-146a的濃度有顯著差異(圖5A~D)。

3討論

布氏菌是一種胞內(nèi)寄生細菌，感染宿主后寄生在宿主體內(nèi)。為了實現(xiàn)胞內(nèi)寄生，布氏菌需要通過各種機制抑制宿主的免疫反應(yīng)，因此，抑制宿主免疫的機制一直是布氏菌致病機制研究的熱點。

microRNA作為宿主免疫調(diào)節(jié)的一種重要機制，已在很多疾病特別是腫瘤等方面，開展了很深入的機制研究，microRNA作為腫瘤診斷的標志物也正在走向臨床實踐。有關(guān)microRNA在布氏菌感染及抑制宿主免疫機制中的作用，目前仍沒有相關(guān)報道。miR-146a是首個被發(fā)現(xiàn)在免疫系統(tǒng)中具有調(diào)節(jié)作用的miRNA，具有負向調(diào)控免疫炎癥反應(yīng)的能力，它的正常表達對防止過度炎癥起著重要的作用[8]。相關(guān)研究顯示，miR-146a在部分惡性腫瘤中表達下調(diào)[9]，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者外周血單個核細胞(PBMCs)中miR-146a表達也有下調(diào)趨勢[10]。于是我們預(yù)測在布病感染中miR-146a的表達也有變化。本研究選取在宿主免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要功能的miR-146a作為研究對象，比較分析了其在布病患者血清中的表達。結(jié)果顯示，與正常健康人相比，布病患者血清中miR-146a被顯著抑制，表明布氏菌通過某種機制或信號途徑，抑制了miR-146a的表達。

研究利用布氏菌感染小鼠巨噬細胞并分析microRNA的表達變化，結(jié)果顯示，let-7b、miR-93、miR-151-3p等miRNAs的表達發(fā)生了顯著改變，但未發(fā)現(xiàn)miR-146a表達有變化，提示miR-146a在布氏菌感染模型與患者的血清中表達有差異[11]。在天然免疫方面，研究發(fā)現(xiàn)miR-146a的啟動子上有一NF-κB結(jié)合位點，通過LPS刺激THP-1(人急性單核細胞白血病細胞)可誘導依賴NF-κB的miR-146a表達上調(diào)。經(jīng)證實，TLR4信號通路中 NF-κB上游的兩個關(guān)鍵基因——白細胞介素1受體相關(guān)激酶1(IRAK1)及腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)是miR-146a的靶基因。miR-146a的表達與IRAK1和TRAF6的表達呈負相關(guān)，于是推測miR-146a可能是TLR受體和相關(guān)細胞信號通路中的一種新的負反饋調(diào)節(jié)因子[12]。有研究顯示布氏菌內(nèi)非經(jīng)典脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是主要的毒力因子之一，而布氏菌的LPS可導致不同的miRNAs反應(yīng)[13,14]；在獲得性免疫方面，miR-146a在活化的T細胞中通過作用其靶基因FADD，發(fā)揮抑制T淋巴細胞的活化誘導細胞死亡(Activation induced cell death AICD)的作用，從而抑制IL-2的產(chǎn)生[15]。而在miR-146a基因敲除小鼠模型中，因miR-146a缺失導致調(diào)節(jié)性T細胞(Treg細胞)部分抑制功能異常，使其喪失對STAT信號通路的抑制作用，IFN-γ表達升高，引起T細胞活化并發(fā)生自身免疫性疾病[16]，研究揭示了miR-146a在Treg細胞發(fā)揮外周免疫耐受中的重要調(diào)節(jié)作用。根據(jù)本次實驗結(jié)果分析，布病患者外周血清中miR-146a表達顯著下調(diào)，說明在布氏菌感染后其表達受到抑制，但其中機制尚不清楚。并且miR-146a的表達量與患者血清抗體滴度相關(guān)，SAT值與miR-146a表達量呈負相關(guān)。然而通過實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-146a的表達與患者的發(fā)病時間并無相關(guān)性，而與布病確診前的臨床表現(xiàn)：發(fā)熱、乏力、關(guān)節(jié)痛和腰背痛有一定的相關(guān)性。這提示miR-146a 在布病的發(fā)生及發(fā)展過程中并無表達上的改變，其激活以及高表達極有可能與細菌感染程度有關(guān)。

綜上所述， miR-146a在布病患者血清中表達顯著下調(diào)，低表達的miR-146a與患者血清抗體滴度檢測值大小密切相關(guān)，可以協(xié)助血清學作出早期診斷。因此，miR-146a表達規(guī)律對于理解布病的致病機制并在布病診斷方面具有一定的應(yīng)用潛力。

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[收稿2015-11-06]

(編輯倪鵬)

Expression pattern of MiR-146a and its correlation with antibody titers in human brucellosis

YUJiu-Xuan,XUXiao-Yang,LEIShuang-Shuang,CHENZe-Liang,WANGJi-Qiu,WANGDa-Li,ZHENGYuan-Qiang,SHIYan-Chun.InnerMongoliaKeyLaboratoryofMolecularBiology,InnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010058,China

[Abstract]Objective:To investigate the expression pattern of microRNA-146a in Brucella patients and its correlation with antibody titers.Methods: By using real time PCR assay,expression levels of microRNA-146a in sera samples from 20 brucellosis patients and 20 healthy volunteers were analyzed.The correlation between expression level of microRNA-146a and serum antibody titers were analyzed with SPSS17.0.Results: A quantification curve of microRNA-146a was constructed with synthesized standard.Expression levels of microRNA-146a among brucellosis patients were significantly lower than those in 20 healthy volunteers(P<0.001).For brucellosis patients,the expression level of microRNA-146a was negatively related with antibody titers (P<0.05).Conclusion: Expression of miRNA-146a in brucellosis patients was significantly inhibited and negatively related with antibody titer.

[Key words]microRNA-146a;Brucellosis;Serum antibody titers

通訊作者及指導教師：鄭源強(1980年-)，男，博士，副教授，主要從事抗感染免疫研究，E-mail:zhengyq688@163.com。

作者簡介：于玖軒(1988年-)，女，碩士，主要從事布魯氏菌病方面研究，E-mail:yujiuxuan0929@163.com。

中圖分類號R392.7

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)02-0230-05

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.019 10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.020