姚　琳，張俊威，王　博，隋美嬌，王偉明

(黑龍江省中醫(yī)藥科學院，黑龍江 哈爾濱　150036)

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芩百清肺濃縮丸對肺炎支原體感染大鼠肺組織中TGF-β和SP-A表達的影響

姚琳，張俊威，王博，隋美嬌，王偉明

(黑龍江省中醫(yī)藥科學院，黑龍江 哈爾濱150036)

摘要：目的探討芩百清肺濃縮丸對肺炎支原體感染大鼠肺組織的修復作用機制。方法60只Wistar大鼠，♀♂各半，體質(zhì)量80～100 g，隨機分為6組，每組10只，分別為空白、模型、陽性對照組，芩百清肺濃縮丸高、中、低劑量組，采用滴鼻法造模；給藥10 d后，腹主動脈采血分離血清，測定血清中IL-6、IL-8及TNF-α的水平；采集大鼠左肺及右肺組織中葉，常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察肺組織病理改變；實時熒光定量PCR法測定肺組織中轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)及表面活性相關蛋白A (SP-A)mRNA的表達；免疫印跡法檢測肺組織中TGF-β、SP-A的蛋白表達。結(jié)果芩百清肺濃縮丸能夠明顯減輕MP感染大鼠肺組織炎癥，可下調(diào)肺組織中TGF-β的表達，并增加SP-A的表達。結(jié)論芩百清肺濃縮丸通過降低TGF-β，抑制肺泡Ⅱ型上皮細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并增加SP-A的表達，恢復肺的正常形態(tài)與功能。

關鍵詞：肺炎支原體；芩百清肺濃縮丸；轉(zhuǎn)化生長因子-β；表面活性相關蛋白A；AEC-Ⅱ；細胞因子

肺炎支原體(mycoplasma pneumonia，MP)是引起呼吸道感染常見的病原體，其引起的肺炎支原體肺炎(mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP)占小兒肺炎發(fā)病率的20%以上，且呈逐年遞增的趨勢。由于其無細胞壁，目前臨床上對于MPP的治療主要應用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，但是該類抗生素長期或反復使用不良反應大、副作用強，在殺滅支原體的同時對患者的機體造成一定的損傷，并且近年來有數(shù)據(jù)表明其耐藥率呈逐年上升的趨勢[1]。因此，開發(fā)一種既可以殺滅支原體，又可以促進受損肺組織修復的藥物顯得尤為重要。

芩百清肺濃縮丸(以下簡稱“芩百”，Qinbai)是我院自主研發(fā)，國家批準第一個用于臨床研究治療小兒支原體肺炎的中藥新藥。由黃芩、百部、地龍、桔梗、麥冬、紫菀6味中藥組成，具有清熱解毒、潤肺止咳之功效。研究表明，其對支原體肺炎具有較好的治療作用，并能夠提高機體免疫功能，促進氣道組織及上皮細胞的修復[2-5]。

本研究通過比較給藥前后，肺炎支原體感染大鼠肺組織中轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factorβ，TGF-β)和表面活性物質(zhì)相關蛋白A(surfactant-associated protein A，SP-A)表達的變化，闡明芩百清肺濃縮丸對肺泡Ⅱ型上皮細胞(type Ⅱ alveolar epithelial cell，AEC-Ⅱ)的修復作用，從而為其促進肺組織修復、恢復肺功能的作用機制提供理論基礎。

1材料

1.1試藥芩百清肺濃縮丸(哈爾濱天合力制藥有限公司，批號130701)，本品為棕褐色的薄膜包衣濃縮水丸，經(jīng)檢查符合2010年版《中華人民共和國藥典》丸劑下的各項規(guī)定。

1.2試劑肺炎支原體國際標準株(ATCCFH15531，購自美國菌種保藏中心)；PPLO培養(yǎng)基(Becton，Dickinson and Company，USA)；IL-6、IL-8及TNF-α酶聯(lián)檢測試劑盒(Uscn公司)；TRIzol試劑(美國Invitrogen，批號66211)；Transcriptor first strand cDNA Synthesis Kit(Roche公司，批號1485422)；FastStart Universal SYBR Green Master (ROX)(Roche 公司，批號10277200)；SP-A、TGF-β、β-actin引物(哈爾濱博仕生物技術有限公司)；TGF-β多克隆抗體(ABCAM公司)；SP-A多克隆抗體(SANTA公司)；高效RIPA組織/細胞裂解液(北京索萊寶科技有限公司)；PMSF(Calbiochem公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天公司)；PVDF膜(Millipore公司)。

1.3動物60只80～100 g的Wistar大鼠♀♂各半，長春億斯實驗動物技術有限公司提供，SPF級，許可證號：SCXK(吉)2011-0004。

1.4儀器SorvaⅡ ST16低溫離心機(Thermo公司)；KD-TS3A自動組織脫水機(浙江金華科迪儀器設備有限公司)；KD-BM生物組織包埋機(浙江金華科迪儀器設備有限公司)；RM2235組織切片機(德國萊卡)；BX4-1生物顯微鏡(OLYMPUS公司)；DP-72 組織生物信號采集分析系統(tǒng)(OLYMPUS公司)；Infinite M200 Pro酶標儀(Tecan公司)；9600定量PCR檢測儀(杭州博日)；VersaDoc 400mp凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司)；DYCZ-24DN電泳槽(北京六一儀器廠)；PowerPac Universal電泳儀(BIO-RAD公司)；半干轉(zhuǎn)膜儀(BIO-RAD公司)。

2方法

2.1動物分組、造模及給藥60只Wistar大鼠隨機分為6組，每組10只，♀♂各半，分別為空白對照組，模型對照組，陽性對照藥組，芩百高、中、低劑量組。大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，除空白對照組外，其余各組大鼠感染106CCU/mL MP菌液50 μL，空白對照組滴入等量MP培養(yǎng)液。感染后d 2開始灌胃給藥，每日1次，空白對照組和模型對照組灌胃等容積生理鹽水；陽性對照組灌胃阿奇霉素(首次給藥量為45 mg·kg-1·d-1，d 2～5為22.5 mg·kg-1·d-1)，連續(xù)給藥5 d；芩百高(3.2 g·kg-1·d-1)、中(1.6 g·kg-1·d-1)、低(0.8 g·kg-1·d-1)劑量組連續(xù)給藥10 d。1%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，分離血清-80℃凍存，用于檢驗血清中IL-6、IL-8及TNF-α的含量；剪取肺組織稱重后取左肺組織4%甲醛固定，用于HE染色；取右肺組織中葉，用于提取RNA和蛋白質(zhì)；剪取脾、胸腺稱重，用于計算臟器指數(shù)。

2.2HE染色實驗取甲醛固定的肺組織，用乙醇梯度脫水，二甲苯透明2次，放入石蠟內(nèi)進行包埋。蠟塊修好后固定于石蠟切片機上切片，將完全展開的蠟片貼附于清潔載玻片上，常規(guī)HE染色，在顯微鏡下進行MP特異性病變間質(zhì)性肺炎的病理組織學檢查。

2.3大鼠血清中IL-6、IL-8及TNF-α的測定采用ELISA法檢測，操作程序按照ELISA試劑盒說明書進行。

2.4大鼠肺組織TGF-β、SP-A mRNA檢測以實時熒光定量PCR法檢測TGF-β和SP-A mRNA的表達。提取RNA，用酶標儀對RNA 純度及濃度進行測定，根據(jù)RNA濃度調(diào)整總RNA的體積，使各樣品逆轉(zhuǎn)錄體系所含的RNA量相同，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，進行聚合酶鏈反應。引物序列[6-8]：TGF-β上游5′-GGCGGTGCTCGCTTTGTA-3′，下游5′-GCCACTCAGGCGTATCAG-3′；SP-A上游5′-TAAGTGCTGCCCTCTGACCT-3′，下游5′-AGGAGCCATACATGCCAAAC-3′；β-actin上游5′-CGTTGACATCCGTAAAGAC-3′，下游5′-TGGAAGGTGGACAGTGAG-3′。

2.5大鼠肺組織TGF-β、SP-A蛋白檢測按試劑盒操作步驟提取并檢測蛋白濃度，相同蛋白濃度加入12% SDS-PAGE凝膠分離并轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉3h，加入一抗稀釋液，4℃孵育過夜，然后將膜與二抗稀釋液在室溫下?lián)u床孵育1 h。最后用化學發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像儀中拍照。

3結(jié)果

3.1大鼠肺組織病理變化來自于動物左肺的組織全部被檢玻片均隨機化檢測。評分系統(tǒng)由1個0～26分范圍的可數(shù)評分組成[9]，5個分類評價系統(tǒng)由管腔周圍浸潤而致的細支氣管和支氣管的數(shù)目、管腔周圍浸潤的程度、管腔內(nèi)滲出的嚴重度、血管周圍浸潤的頻度、實質(zhì)性肺炎的嚴重度合并后記分，每張切片選擇5個視野評分。

空白組可見肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，肺泡腔內(nèi)未見水腫液，肺組織中未見炎性細胞浸潤。模型組可見明顯的炎癥，病變性質(zhì)為間質(zhì)性肺炎和細支氣管肺炎，肺泡壁增厚、水腫、脫落，氣管支氣管周圍及其腔內(nèi)、血管周圍及肺泡腔內(nèi)伴以淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤，嚴重者伴有紅細胞滲入。而芩百各組的肺組織相對于模型組上述改變明顯減輕，呈現(xiàn)明顯的量效關系(Tab1，F(xiàn)ig 1)。

Tab1Effect of Qinbai on histological score in lung

△△P<0.01vsblank；**P<0.01vsmodel

A:Blank; B: Model; C: Azithromycin; D:Qinbai(High); E:Qinbai(Middle);F:Qinbai(Low)

3.2大鼠肺指數(shù)、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)測定與空白組比較，模型組肺指數(shù)、脾指數(shù)明顯增加(P<0.05)，胸腺指數(shù)明顯降低(P<0.01)。各給藥組肺指數(shù)降低，但與模型組比較，差異無顯著性；胸腺指數(shù)明顯增加(P<0.05)；脾指數(shù)明顯降低(P<0.05)(見Tab2)。

3.3大鼠血清中IL-6、IL-8及TNF-α的測定由Tab3可知，與空白組比較，模型組大鼠血清中IL-6、IL-8和TNF-α水平均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組中3者數(shù)值均有所下調(diào)，其中阿奇霉素組及芩百高、中組對IL-6、IL-8的下調(diào)作用明顯(P<0.05)，而阿奇霉素組及芩百高劑量組對TNF-α的下調(diào)明顯(P<0.05)。

3.4大鼠肺組織TGF-β、SP-A mRNA和蛋白表達結(jié)果顯示，與模型組比較，芩百各劑量組TGF-β基因和蛋白表達明顯下降(P<0.05)，且高劑量組下降明顯；而SP-A基因和蛋白表達明顯增加(P<0.05)，同樣，高劑量組表達更加明顯(Tab4，5，F(xiàn)ig 2)。

4討論

MPP的主要病理表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎，通過本實驗可以看出，芩百各劑量組能夠明顯減輕MP感染引起的大鼠肺部間質(zhì)性炎癥的改變，使肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)趨向正常，損傷得到修復。對各組病理組織按照制定的評分標準進行半定量積分，與直接觀察病理組織比較能更客觀地評價疾病的輕重程度，評分后進行統(tǒng)計分析，可以更直觀地比較各組之間的差異，使結(jié)果更具有統(tǒng)計學意義。通過對大鼠臟器指數(shù)的測定可知，芩百還可以改善肺指數(shù)、胸腺指數(shù)及脾指數(shù)，提示其能夠殺滅清除體內(nèi)的MP，對免疫器官刺激減輕，能夠調(diào)節(jié)由MP引起的免疫紊亂情況。

MP侵入人體后，可刺激淋巴細胞等產(chǎn)生IL-2、IL-6、IL-8、IL-10及TNF-α等多種細胞因子。正常情況下，這些因子對機體具有保護作用，但如果過度分泌則會引起疾病的產(chǎn)生及炎癥的加重。已有研究表明IL-6、IL-8及TNF-α的大量釋放是引起繼發(fā)性肺損傷的重要因素之一，目前已被研究人員和臨床醫(yī)生所認可，認為其作為MPP臨床診斷指標更為敏感[10]。本實驗結(jié)果表明，芩百能夠明顯降低大鼠血清中上述炎癥因子的表達，從而減輕肺部炎癥反應，肺損傷得到修復。

MP感染后反復發(fā)作，遷延不愈是臨床治療的難點，尤其多次復發(fā)后引起MP耐藥是目前MPP治療的最大難題。MPP的發(fā)病機制復雜，由MP感染引起的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化可能是其難痊愈原因之一。AEC-Ⅱ是肺泡上皮的干細胞，是合成和分泌肺泡表面活性物質(zhì)及其相關蛋白的主要細胞。當MP感染宿主時，MP與AEC-Ⅱ細胞膜上的SP-A結(jié)合，激活巨噬細胞等炎細胞吞噬作用，釋放TGF-β等細胞因子，TGF-β與上皮細胞相應受體結(jié)合，細胞支架重排，促進AEC-Ⅱ發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，其特征

△P<0.05,△△P<0.01vsblank；*P<0.05，**P<0.01vsmodel

△P<0.05vsblank；*P<0.05vsmodel

△△P<0.01vsblank；*P<0.05，**P<0.01vsmodel.

Tab5Effects of Qinbai on TGF-β and SP-A expression

△△P<0.01vsblank；*P<0.05，**P<0.01vsmodel

是失去上皮特性獲得間質(zhì)屬性。AEC-Ⅱ損傷后，上皮通透性增加，肺表面活性物質(zhì)相關蛋白的合成和分泌降低[11]。因此，TGF-β在AEC-Ⅱ發(fā)生EMT過程中起著非常重要的作用[12]。TGF-β能夠誘導肺泡上皮細胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，引發(fā)間質(zhì)性肺炎，嚴重者導致肺纖維化，作用通路與Smad信號轉(zhuǎn)導途徑相關[6]，也有研究報道TGF-β能激活非Smad介導的細胞信號途徑[13]。還有人認為，TGF-β能夠抑制上皮細胞增生，其表達升高可能減弱上皮細胞的再生能力，從而間接影響呼吸道的修復[14]，而呼吸道生理結(jié)構(gòu)的不完整又為MP再次感染提供了適宜條件。因此，對MPP的治療不僅僅限于清除病原微生物上，更應該抑制炎癥反應進程，促進各炎癥因子間平衡制約，加快上皮細胞修復，使呼吸道微環(huán)境恢復至正常生理狀態(tài)。本實驗結(jié)果表明芩百各劑量組能夠降低TGF-βmRNA和蛋白的表達，說明其能夠抑制AEC-Ⅱ發(fā)生EMT，使AEC-Ⅱ得到修復，恢復其正常生理功能。

EMT的主要表現(xiàn)為上皮細胞丟失上皮標記物，其最具特征的表面標記物是表面活性蛋白(SP-A、SP-B和SP-C)，而這些蛋白中SP-A最早被發(fā)現(xiàn)，且在AEC-Ⅱ中表達最強烈，信號最豐富的蛋白，約占SP總量的50%，是表面活性物質(zhì)(PS)最重要的蛋白成分，其主要生理功能為降低肺泡表面張力，促進液體吸收，防止肺萎陷和肺水腫，以及對維持肺泡正常結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定通氣具有重要作用；還參與調(diào)節(jié)肺的局部免疫和炎癥反應，并在多種因素致肺損傷中對肺泡具有保護作用。

MP感染宿主后，與SP-A結(jié)合，刺激巨噬細胞和中性粒細胞，產(chǎn)生大量細胞因子和炎癥介質(zhì)，打破了炎癥介質(zhì)/抗炎介質(zhì)的平衡。此時，炎癥介質(zhì)對AEC-Ⅱ的作用使SP-A mRNA的表達受到影響，AEC-Ⅱ凋亡、裂解、壞死使AEC-Ⅱ數(shù)目減少，而AEC-Ⅱ在短時間內(nèi)不能及時增生，凋亡、壞死的AEC-Ⅱ不能及時得到補充和代償，所有這些導致SP-A mRNA下調(diào)。隨著SP-A mRNA下調(diào)效應的積累、疊加與放大，AEC-Ⅱ內(nèi)SP-A的生成減少，肺組織中SP-A蛋白表達逐漸下降。本實驗結(jié)果表明，芩百各劑量組可使炎癥介質(zhì)水平降低，炎癥介質(zhì)對SP-A mRNA的抑制作用減弱，AEC-Ⅱ得到修復、增生使SP-A mRNA表達增強，同時隨著SP-A基因表達的增多，被翻譯蛋白量增加，其蛋白表達提高。

本研究闡明了芩百清肺濃縮丸通過降低TGF-β表達，抑制AEC-Ⅱ發(fā)生EMT，促進AEC-Ⅱ合成和分泌SP-A， SP-A表達增加，對肺組織起到保護和修復的作用，恢復其正常形態(tài)和生理功能。

(致謝：本實驗在我院動物室、藥理室完成，感謝以上科室崔花子、張志華兩位老師的指導，張俊威、王博兩位同事的幫助以及隋美嬌同學的配合。)

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(TGF-β) and surface activity related protein A(SP-A) mRNA expression level by real-time quantitative PCR(RT-PCR) and TGF-β and SP-A protein expression by (Western blot.ResultQinbai Qingfei Concentrated)pellets significantly inhibited inflammation of lung tissue, reduced the expression of TGF-β and increased the expression of SP-A in the lung tissue of rats infected by mycoplasma.ConclusionQinbai Qingfei Concentrated pellets can inhibit epithelial-mesenchymal transition (EMT),of alveolar type Ⅱ epithelial cells by reducing the content of TGF-β and restore the normal morphology and function of the lung by increasing the expression of SP-A.

Effect of Qinbai Qingfei Concentrated pellets on TGF-β and SP-A expression in lung tissue of rats infected by mycoplasmal pneumonia

YAO Lin，ZHANG Jun-wei，WANG Bo，SUI Mei-jiao，WANG Wei-ming

(HeilongjiangAcademyofChineseMedicalSciences，Harbin150036，China)

Key words:mycoplasma pneumonia；Qinbai Qingfei Concentrated pellets；TGF-β；SP-A；AEC-Ⅱ；cytokine

Abstract:AimTo discuss the repairing mechanism of Qinbai Qingfei Concentrated pellets to lung tissue of rats infected by mycoplasma.Method60 Wistar rats weighting 80～100 g, male to female: 1 ∶1) were divided into six groups randomly (10 rats in each group): blank group, model group, positive group, the high、middle and low dose groups of Qinbai Qingfei Concentrated pellets.Rats were infected through nasal intubation drip of MP. After 10 days of administration, concentrations of IL-6, IL-8 AND TNF-α in serum of MPP rats were detected. Left pulmonary tissues of rats were collected to observe the lung tissue pathological change by HE staining and right pulmonary tissues were used to detect the transforming growth factor-beta

收稿日期:2015-12-11,修回日期:2016-02-05

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No 81374045)；國家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大新專項(No 2010ZX09101-104)

作者簡介:姚琳(1980-)，女，博士，副主任藥師，研究方向：新藥研發(fā)。Tel：0451-55665478，E-mail：yaoyao198003@aliyun.com; 王偉明(1966-)，女，博士，研究員，研究方向：新藥研發(fā)，通訊作者，Tel：0451-55665478，E-mail：342201601@qq.com

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.04.024

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)04-0564-06

中國圖書分類號：R-332；R282.71；R322.35；R375.2；R563.13；R9777.6

網(wǎng)絡出版時間：2016-3-18 11:22網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.048.html

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