聶品晶，陳蘇寧

中藥益心康修復(fù)感染柯薩奇B3病毒大鼠心肌細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究

聶品晶，陳蘇寧*

[摘要]目的觀察中藥益心康對(duì)感染柯薩奇B3病毒大鼠心肌細(xì)胞損傷的修復(fù)作用，探討其作用機(jī)制。方法將中藥益心康提取液作用于感染柯薩奇B3病毒的大鼠心肌細(xì)胞，觀察心肌細(xì)胞的細(xì)胞病變情況、心肌細(xì)胞存活率及心肌酶學(xué)水平的變化。結(jié)果益心康組、利巴韋林組的細(xì)胞病變率低于病毒對(duì)照組，益心康組細(xì)胞病變率低于利巴韋林組。細(xì)胞對(duì)照組、益心康組、利巴韋林組的細(xì)胞存活率高于病毒對(duì)照組(P<0.05)，益心康組細(xì)胞存活率高于利巴韋林組(P<0.05)。細(xì)胞對(duì)照組、益心康組、利巴韋林組的細(xì)胞肌酸激酶、肌鈣蛋白Ⅰ低于病毒對(duì)照組(P<0.05)，益心康組肌酸激酶、肌鈣蛋白Ⅰ低于利巴韋林組(P<0.05)。結(jié)論中藥益心康具有修復(fù)感染柯薩奇B3病毒大鼠心肌細(xì)胞損傷的作用。

[關(guān)鍵詞]益心康；柯薩奇病毒B3；心肌細(xì)胞；細(xì)胞病變；MTT；CK；cTnI

[Abstract]ObjectiveTo observe the repairment effect of yixinkang on the rats′ cardiomyocytes infected by CVB3virus.MethodsYixinkang was used on rats′ cardiomyocytes which were infected by CVB3virus,the morphological changes and CPE of the rats were observed,and the survival rate of cardiomyocytes,the CK and cTnI were detected by ELISA methods.ResultsThe CPE in cell control group,yixinkang group and ribavirin group were lighter than those of virus control group (P<0.05).The CPE of yixinkang group was lighter than that of ribavirin group (P<0.05).The cell survival rates in cell control group,yixinkang group and ribavirin group were higher than those of virus control group (P<0.05),and the rate of yixinkang group was higher than that of ribavirin group (P<0.05).The levels of CK and cTnI in cell control group,yixinkang group and ribavirin group were lower than those of virus control group (P<0.05),and the levels in yixinkang group were lower than those of ribavirin group (P<0.05).ConclusionYixinkang has repairment effect on the injury of cardiomyocytes infected by CVB3.

收稿日期：2015-08-24

基金項(xiàng)目：武警部隊(duì)后勤科研項(xiàng)目(WJH2012-20)；武警后勤學(xué)院院級(jí)基礎(chǔ)項(xiàng)目(WHJ2014022)；武警后勤學(xué)院科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目(WHTD201306)

通信作者*

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201512005

Repairment effect of yixinkang on the injury of rats′ cardiomyocytes infected by CVB3virusNIE Pin-jing,CHEN Su-ning*(Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Key words：Yixinkang;Coxsackie virus B3(CVB3);Cardiomyocytes;Cell pathological changes;MTT;CK;cTnI

0引言

病毒性心肌炎(Virus myocarditis，VMC)是指嗜心肌病毒感染引起的以心肌非特異性炎癥為主要病變的心肌疾病，近年來(lái)其發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)。致病病毒以柯薩奇B組病毒(Coxsackic virus B，CVB3)最為常見(jiàn)，約占30%~50%。在急性期和亞急性期，病毒在心肌組織中大量復(fù)制，導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，也可通過(guò)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)間接引起心肌細(xì)胞損傷。臨床表現(xiàn)主要有心悸、胸痛、呼吸困難等，嚴(yán)重者甚至?xí)炟?、猝死。西醫(yī)治療方法主要有抗病毒、營(yíng)養(yǎng)心肌、抗心律失常等，療效不理想[1-2]。中醫(yī)將該病歸入“心悸”、“怔忡”范疇[3]，在歷代典籍中對(duì)于該病的治療有諸多記載。筆者根據(jù)祖國(guó)醫(yī)學(xué)理論，結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為該病正氣不足、邪氣侵心是病機(jī)關(guān)鍵，治療應(yīng)以扶正祛邪、清熱解毒、活血通絡(luò)為主，因此，筆者應(yīng)用中藥益心康治療該病，并進(jìn)行了相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究[4-5]。本研究通過(guò)原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞的方法，建立了CVB3病毒體外感染心肌細(xì)胞的模型，通過(guò)對(duì)心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及細(xì)胞病變的觀察，從細(xì)胞、分子生物學(xué)水平對(duì)心肌細(xì)胞存活率、肌酸激酶(CK)、心肌肌鈣蛋白(cTnI)進(jìn)行研究，探討益心康修復(fù)感染柯薩奇病毒大鼠心肌細(xì)胞損傷的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料藥物與試劑：益心康(人參、黃芪、金銀花、連翹、板藍(lán)根、白術(shù)、丹參、甘草)購(gòu)自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥局，其提取物由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院中藥制劑實(shí)驗(yàn)室用水提醇沉法提取(流程：取益心康飲片250 g，加水煎煮3次，人參單煎，濾過(guò)后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮藥液至100 mL，在恒溫振蕩器上震蕩藥液并緩慢加乙醇，使含醇量達(dá)75%，4 ℃靜置冷藏過(guò)夜、濾過(guò)，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上回收乙醇至無(wú)醇味的浸膏，用蒸餾水稀釋至100 mL，用1 mL EP管分裝，在高速離心機(jī)上以15 000 r/min離心10 min，取上清液用除菌濾膜過(guò)濾備用[6])。利巴韋林注射液：華北制藥有限公司，規(guī)格：1 mL∶100 mg。DMEM培養(yǎng)基：GIBCO，批號(hào)：545189。標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(天津擷洋，生產(chǎn)批號(hào)：20100310，規(guī)格100 mL)，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，sigma，規(guī)格：250 mg)。CK、cTnI、ELISA試劑盒：貝基生物，批號(hào)：20100210。

動(dòng)物：出生3 d的SD大鼠乳鼠，雌雄不限，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，批號(hào)：sky2008-2013。細(xì)胞：HeLa細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供。病毒：CVB3病毒Nancy株，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)兒科病毒室提供。CVB3病毒擴(kuò)增：取單層貼壁生長(zhǎng)的HeLa細(xì)胞，加CVB3病毒原液l mL，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)吸附1 h，棄掉病毒液，加8 mL維持液繼續(xù)培養(yǎng)，逐日用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。細(xì)胞形態(tài)變圓，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞脫壁，結(jié)聚成團(tuán)等變化為細(xì)胞病變(CPE)，CPE出現(xiàn)75%~100% (+++~++++)時(shí)停止細(xì)胞培養(yǎng)。反復(fù)吹打使細(xì)胞完全脫落，反復(fù)凍融3次，使細(xì)胞充分裂解，釋放出病毒顆粒。3 000 r/min離心15 min，取上清液，以0.22 μm的小濾器過(guò)濾，EP管分裝，-80 ℃保存留待進(jìn)行CVB3病毒毒力滴定[7-8]。

儀器：倒置熒光顯微鏡：德國(guó)萊卡LEIT20MIL；生物安全柜：美國(guó) NVAIRE425-400；立式壓力蒸汽滅菌器：SHINVA LMQJ3260；循環(huán)水式真空泵：鄭州長(zhǎng)城SHB-Ⅲ；二氧化碳培養(yǎng)箱：美國(guó)NVAIRE-4950E；水浴恒溫振蕩器：江蘇金壇SHA-B；低速離心機(jī)：江蘇金壇 800；半自動(dòng)生化分析儀：德國(guó)EPPENDORF。

1.2方法

1.2.1心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)在無(wú)菌條件下，取出SD大鼠心臟，將心臟用無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS溶液反復(fù)洗滌3次后，剪去心房、大血管等組織。然后將剩余組織剪成0.1 mm3的碎塊。將心肌組織碎塊加入5 mL的0.32%胰蛋白酶溶液中，置于水浴恒溫振蕩器，在37 ℃水浴中消化40 min，待心肌組織碎塊充分消化后加2 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，在高速離心機(jī)上以1 500 r/min離心15 min，重復(fù)2次。吸棄上清液，再加入5 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，將細(xì)胞沉淀混勻，制成細(xì)胞懸液，用200目篩過(guò)濾，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)后，分裝于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板及50 mL細(xì)胞瓶中，培養(yǎng)瓶每瓶接種5×105/mL細(xì)胞8 mL；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔中接種2×105/mL細(xì)胞200 μL，放入37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后鏡下觀察到心肌細(xì)胞貼壁梭形、三角形，有偽足，形成單層的細(xì)胞呈放射狀，呈同步搏動(dòng)，搏動(dòng)速率多在60~80次/min。心肌細(xì)胞培養(yǎng)成功[9-10]。

1.2.2CVB3病毒半數(shù)組織感染量(TCID50)的測(cè)定[6]用含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將病毒連續(xù)10倍稀釋成10-1~10-1010個(gè)濃度，接種于培養(yǎng)有單層生長(zhǎng)的原代心肌細(xì)胞的96孔板，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，另設(shè)4個(gè)正常對(duì)照孔。觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化情況(CPE)，結(jié)果表示方法如下：“-”細(xì)胞正常，“+”25%細(xì)胞產(chǎn)生病變，“++”50%細(xì)胞產(chǎn)生病變，“+++”75%細(xì)胞產(chǎn)生病變，“++++”100%細(xì)胞產(chǎn)生病變。以細(xì)胞病變達(dá)“++”以上為陽(yáng)性，以最高稀釋度不再出現(xiàn)CPE時(shí)為終點(diǎn)。用Reed-Muench法計(jì)算TCID50為10-4.22，本實(shí)驗(yàn)取CVB3病毒稀釋濃度為10-4。

1.2.3中藥益心康提取物及利巴韋林注射液對(duì)心肌細(xì)胞最大無(wú)毒劑量(TCID0)的測(cè)定[6]將中藥益心康提取物及利巴韋林注射液用2%胎牛血清的DMEM分別稀釋成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024、1∶2 048、1∶4 096 12個(gè)濃度，加入單層生長(zhǎng)的原代心肌細(xì)胞的96板中，每組均設(shè)8個(gè)復(fù)孔，另設(shè)8個(gè)正常心肌細(xì)胞對(duì)照孔。記錄各孔細(xì)胞的CPE情況，不出現(xiàn)CPE的藥物最小稀釋倍數(shù)為益心康提取物及利巴韋林注射液的最大無(wú)毒劑量。中藥益心康提取液的最大無(wú)毒劑量為含生藥量2.44 mg/mL，稀釋比例為1∶1 024。利巴韋林的最大無(wú)毒劑量為6.25 mg/mL，稀釋比例為1/16。

1.2.4感染CVB3病毒大鼠心肌細(xì)胞模型的制備及實(shí)驗(yàn)分組取長(zhǎng)成單層乳鼠心肌細(xì)胞，分成4組：①細(xì)胞對(duì)照組，②病毒對(duì)照組，③益心康組，④利巴韋林組。各組單層細(xì)胞中，除細(xì)胞對(duì)照組外，其余各組加入濃度為100 TCID50CVB3的病毒液(96孔板，0.1 mL/孔，培養(yǎng)瓶4 mL/瓶)。37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，使病毒和細(xì)胞充分接觸1 h后，棄病毒液，用PBS洗滌3遍，向各組細(xì)胞中加入藥物：①組、②組中各加入含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(96孔板，0.2 mL/孔，培養(yǎng)瓶8 mL/瓶)；③組中加入益心康提取液及含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液的1∶1混合液(96孔板，0.2 mL/孔，培養(yǎng)瓶8 mL/瓶)，益心康提取液濃度為含生藥量2.44 mg/mL(稀釋比例為1∶1 024)；④組加利巴韋林及含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液的1∶1混合液(96孔板，0.2 mL/孔，培養(yǎng)瓶8 mL/瓶)，利巴韋林的濃度為6.25 mg/mL(稀釋比例為1∶16)。

1.2.5心肌細(xì)胞CPE情況將各組細(xì)胞置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24、48 h在倒置顯微鏡下觀察CPE情況，記錄結(jié)果，結(jié)果表示方法如下：“-”細(xì)胞正常，“+”25%細(xì)胞產(chǎn)生病變，“++”50%細(xì)胞產(chǎn)生病變，“+++”75%細(xì)胞產(chǎn)生病變，“++++”100%細(xì)胞產(chǎn)生病變。

1.2.6MTT法測(cè)細(xì)胞存活率各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，吸棄培養(yǎng)液，每孔中加含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液100 μL、MTT液20 μL，37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)4 h，吸棄各孔中的液體，向各培養(yǎng)孔中加入100 μL二甲基亞砜(DMSO)，將96孔板放在振蕩器上振蕩10 min，充分混勻，置于酶標(biāo)儀上測(cè)波長(zhǎng)570 nm吸光度(Optical density，OD)值。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)孔OD值/對(duì)照孔OD值)×100%。

1.2.7ELISA法測(cè)定肌酸激酶和肌鈣蛋白Ⅰ各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用吸管吹打收集貼壁生長(zhǎng)的心肌細(xì)胞，用超聲粉碎機(jī)粉碎3次，在高速離心機(jī)上2 000 r/min離心1 min后收集上清液(每組1.5 mL)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)用ELISA法測(cè)肌酸激酶和肌鈣蛋白Ⅰ。

1.2.8統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以±s表示，各組均數(shù)比較采用方差分析及t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組心肌細(xì)胞CPE比較見(jiàn)表1。

表1　各組心肌細(xì)胞CPE比較

各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖1~圖4。細(xì)胞對(duì)照組心肌細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，向周?chē)斐龇派錉钔黄?，心肌?xì)胞呈同步搏動(dòng)(60~80次/min)，節(jié)律規(guī)整，搏動(dòng)有力。病毒對(duì)照組心肌細(xì)胞在接種病毒后24 h，細(xì)胞仍搏動(dòng)但速度較慢，節(jié)律欠規(guī)整，開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞病變；接種病毒48 h，可見(jiàn)細(xì)胞團(tuán)縮、破碎等細(xì)胞病變，基本停止搏動(dòng)。益心康組、利巴韋林組與病毒對(duì)照組比較，病變明顯減輕。益心康組細(xì)胞病變輕于利巴韋林組。

圖1　細(xì)胞對(duì)照組48 h細(xì)胞生長(zhǎng)情況(×100)

圖2　病毒對(duì)照組48 h細(xì)胞生長(zhǎng)情況(×400)

2.2MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，MTT法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞存活率，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，細(xì)胞對(duì)照組、益心康組、利巴韋林組的細(xì)胞存活率均高于病毒對(duì)照組(P<0.05)。益心康組細(xì)胞存活率高于利巴韋林組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2　MTT法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞的存活率(%)

2.3各組CK及cTnI比較干預(yù)48 h后，各組CK及cTnI結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，細(xì)胞對(duì)照組、益心康組、利巴韋林組細(xì)胞上清液CK、cTnI均低于病毒對(duì)照組(P<0.05)，且益心康組低于利巴韋林組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3　益心康組48 h細(xì)胞生長(zhǎng)情況(×400)

圖4　利巴韋林組48 h細(xì)胞生長(zhǎng)情況(×400)

組別CKcTnI細(xì)胞對(duì)照組70.65±7.42180.12±8.37病毒對(duì)照組248.37±19.551595.30±457.37益心康組84.51±13.07466.00±52.03利巴韋林組134.00±13.51599.62±40.03

3討論

中醫(yī)認(rèn)為，病毒應(yīng)歸入中醫(yī)病因?qū)W的“六淫”范疇，病毒性心肌炎屬于外感病范疇。如果人體正氣充足，六淫之邪不能侵襲人體。反之，當(dāng)人體因先天稟賦、飲食、勞逸等因素影響而正氣不足時(shí)，易受六淫邪氣的侵襲，導(dǎo)致病毒性心肌炎等外感疾病的發(fā)生。中藥益心康是針對(duì)病毒性心肌炎“正氣不足，邪氣侵心”的病機(jī)，以扶正祛邪、清熱解毒、活血通絡(luò)為治療原則，從《太平惠民和劑局方》四君子湯加減化裁而得，其配伍組成中人參、黃芪扶正益氣固表為主藥，輔以白術(shù)健脾，合主藥以補(bǔ)脾而助氣血生化之源，使氣充血旺，扶助正氣。佐以金銀花、連翹、板藍(lán)根清熱解毒以祛邪，丹參活血通脈，甘草清熱解毒調(diào)和諸藥。諸藥合用，共奏祛邪扶正、清熱解毒之功，多年來(lái)應(yīng)用于病毒性心肌炎取得了很好的療效。

柯薩奇B3病毒侵襲人體可以直接損傷心肌細(xì)胞，或通過(guò)免疫機(jī)制損傷心肌細(xì)胞。病毒性心肌炎在急性期和亞急性期，病毒在心肌組織中大量復(fù)制，導(dǎo)致心肌細(xì)胞的損傷，也可通過(guò)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)間接引起心肌細(xì)胞損傷。病毒感染1~3周內(nèi)，臨床表現(xiàn)有發(fā)熱、咽痛、腹瀉、全身酸痛等呼吸道和消化道癥狀。感染1~3周后，出現(xiàn)心悸、氣短、心前區(qū)不適或隱痛，重者出現(xiàn)呼吸困難或浮腫等心臟受累的表現(xiàn)。在慢性期，病毒持續(xù)低水平復(fù)制，導(dǎo)致心肌細(xì)胞纖維化，引起擴(kuò)張性心肌病?？梢?jiàn)心肌損傷在病毒性心肌炎的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，臨床治療病毒性心肌炎也應(yīng)重視對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)。本研究中，中藥益心康組心肌細(xì)胞CPE情況較病毒對(duì)照組和利巴韋林組輕微，細(xì)胞存活率高于病毒對(duì)照組和利巴韋林組，CK、cTnI低于病毒對(duì)照組和利巴韋林組，表明中藥益心康具有明顯的保護(hù)受損心肌細(xì)胞的作用，進(jìn)一步驗(yàn)證本方是治療病毒性心肌炎的有效方劑，為中藥益心康治療病毒性心肌炎提供了新的理論依據(jù)。

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作者單位：1.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津300193;2.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院腦科醫(yī)院，天津300162;3.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)療科，天津300162