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NO前體藥物JS-K體外對(duì)乙肝病毒HBsAg和HBeAg的影響

王歡1,2，周艷萌2，勾英2，劉正蕓3，惠景1，劉杰3

(遵義醫(yī)學(xué)院1. 醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心； 2. 微生物學(xué)教研室；3.基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 觀察一氧化氮前體藥物JS-K體外對(duì)乙肝病毒HBsAg和HBeAg的影響。方法 以攜帶有HBV基因組的HepG2.2.15細(xì)胞作為研究工具，MTT法檢測(cè)JS-K(0、1、2、5、10 μM)對(duì)細(xì)胞的毒性作用；熒光染色檢測(cè)JS-K作用于細(xì)胞后一氧化氮的釋放情況；ELISA及免疫熒光結(jié)合激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)的方法，檢測(cè)不同濃度JS-K對(duì)細(xì)胞中HBsAg和HBeAg表達(dá)的影響。結(jié)果 包括最高濃度組(10 μM)在內(nèi)的各濃度JS-K對(duì)細(xì)胞均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)；JS-K作用于細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)一氧化氮的釋放明顯增多；隨著JS-K濃度的增高，HBsAg的表達(dá)明顯降低，HBeAg的表達(dá)有一定的減少。結(jié)論 一氧化氮前體藥物JS-K在體外對(duì)乙肝病毒的抗原有一定的抑制作用。

[關(guān)鍵詞]一氧化氮；JS-K；乙型肝炎病毒

目前乙肝的抗病毒治療藥物主要有干擾素和核苷類似物[1]，這些治療方法主要是通過抑制病毒復(fù)制中的關(guān)鍵酶類而干預(yù)病毒復(fù)制過程，或者針對(duì)宿主抗病毒的不同環(huán)節(jié)而發(fā)揮抗病毒作用。這些藥物雖有一定的療效，但也存在病毒不易被完全清除、停藥后反跳等不良反應(yīng)，而且針對(duì)核苷類似物的耐藥性也逐漸增加。因此，新型抗乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)藥物的研究具有重要意義。一氧化氮(nitric oxide, NO)主要是由L-精氨酸在一氧化氮合酶(NOS)的催化下產(chǎn)生的一種氣態(tài)自由基，具有維持血管張力的恒定、調(diào)節(jié)血壓穩(wěn)定及腦血流、促進(jìn)記憶過程、殺傷細(xì)菌病毒及腫瘤細(xì)胞等多種生物學(xué)功能。JS-K是一種具有特定靶向性的偶氮鎓二醇鹽類NO供體藥物[2](也稱前體藥物)，它能在谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)作用下釋放定量的NO。為了尋找新型抗HBV藥物，因此我們以HepG2.2.15細(xì)胞作為工具，對(duì)JS-K的抗HBV活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞：HepG2.2.15細(xì)胞購于湘雅醫(yī)學(xué)院，由本室保存。主要試劑：JS-K由Dr. Keefer (NCI at Frederick)教授惠贈(zèng)；DMEM培養(yǎng)基以及進(jìn)口胎牛血清購于Hyclone公司；MTT、DAF-FM DA(一氧化氮熒光探針)以及DAPI購于碧云天生物技術(shù)公司；HBsAg和HBeAg的ELISA檢測(cè)試劑盒均為中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司產(chǎn)品；HBsAg及HBeAg抗體購于博奧森生物技術(shù)公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1JS-K對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)將對(duì)數(shù)生長期的HepG2.2.15細(xì)胞消化后接種于96孔板中，細(xì)胞濃度為5×103個(gè)/100 μL/孔；次日待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的JS-K，每組設(shè)6個(gè)平行孔，然后將板置于37 ℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)。72 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去孔中液體，加入DMSO，100 μL/孔，輕輕搖晃，使其結(jié)晶物充分溶解，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)OD490的值，并按下述公式計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組平均 OD 值/對(duì)照組平均 OD值

1.2.2NO檢測(cè)將HepG2.2.15細(xì)胞接種于petri皿中，次日待細(xì)胞貼壁后加入終濃度為10 μM的JS-K，作用24 h后用于NO的檢測(cè)。按照說明書，用DAF-FM DA稀釋液稀釋DAF-FM DA，至終濃度為5 μM。棄去皿中的培養(yǎng)液，加入500 μL稀釋后的DAF-FM DA，置37 ℃培養(yǎng)箱中孵育20 min，PBS洗3次，以除去未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DAF-FM DA。將皿置于激光共聚焦顯微鏡下(激發(fā)波長：495 nm，發(fā)射波長：515 nm)檢測(cè)熒光的情況。

1.2.3ELISA法檢測(cè)HBsAg和HBeAg不同濃度的JS-K作用于HepG2.2.15細(xì)胞72 h后收集各組上清用于HBsAg和HBeAg的檢測(cè)，具體檢測(cè)步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，最后在波長450 nm下檢測(cè)各組吸光度。

1.2.4免疫熒光法檢測(cè)HBsAg和HBeAg的表達(dá)用4%多聚甲醛對(duì)JS-K作用后的HepG2.2.15細(xì)胞在室溫下固定10 min，PBS清洗3次。0.1% Triton X-100作用10 min，PBS清洗3次；封閉液室溫孵育30 min后，加入適量稀釋后的一抗，置于濕盒中4 ℃過夜，PBS清洗3次；避光滴加熒光素標(biāo)記的二抗，置于濕盒中室溫1 h，PBS清洗3次；DAPI復(fù)染細(xì)胞核，PBS清洗3次，封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

2結(jié)果

2.1JS-K對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的毒性作用由圖1可見，與對(duì)照組比較，各濃度組的細(xì)胞存活率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示JS-K在濃度10μM以內(nèi)對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞無明顯毒性作用。

圖1　JS-K對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞生長的影響

2.2JS-K對(duì)NO水平的影響用特異性熒光探針DAF-FM DA標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的NO后，對(duì)照組細(xì)胞具有較弱的綠色熒光，即胞內(nèi)NO水平較低，10μM的JS-K作用24 h后細(xì)胞內(nèi)的熒光信號(hào)明顯高于對(duì)照組，提示作為NO前體的JS-K作用于細(xì)胞后，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)NO水平明顯升高(見圖2)。

2.3JS-K對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg表達(dá)的影響不同濃度的JS-K作用于HepG2.2.15細(xì)胞72h后，用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中HBsAg的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：隨著JS-K濃度的增高，HBsAg的表達(dá)明顯降低，當(dāng)JS-K濃度達(dá)到10μM時(shí)，HBsAg的表達(dá)量降低了70%以上(見圖3)；同時(shí)，通過免疫熒光，利用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)顯示HBsAg(綠色熒光)主要表達(dá)在胞漿，JS-K作用后HBsAg明顯減弱(見圖3)，提示JS-K有非常顯著的抑制HBsAg的作用。

A:對(duì)照組；B：JS-K組。圖2　JS-K對(duì)NO表達(dá)的影響(×630)

A:對(duì)照組；B：JS-K組；各濃度組與對(duì)照組比較，* P<0.05，** P<0.01。圖3　JS-K對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg表達(dá)的影響

2.4JS-K對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBeAg表達(dá)的影響不同濃度的JS-K作用于HepG2.2.15細(xì)胞72h后，用ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中HBeAg的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：隨著JS-K濃度的增高，HBeAg的表達(dá)明顯降低，當(dāng)JS-K濃度達(dá)到5μM時(shí)，HBeAg的表達(dá)量降低了30%左右，而隨著用藥濃度的進(jìn)一步增高(>5μM)，HBeAg的表達(dá)并未繼續(xù)降低，而是基本維持在與5μM時(shí)的相似水平(見圖4)，提示JS-K在一定范圍內(nèi)具有抑制HBeAg表達(dá)的作用。同時(shí)，免疫熒光結(jié)果也顯示，HBeAg(綠色熒光)在胞漿和胞核中都有表達(dá)，但大多集中在胞漿中近胞核處，JS-K作用后，HBeAg的表達(dá)有一定減弱(見圖4)。

A:對(duì)照組；B：JS-K組；各濃度組與對(duì)照組比較，* P<0.05，** P<0.01。圖4　JS-K對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBeAg表達(dá)的影響

3討論

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)相關(guān)性疾病已成為當(dāng)今威脅人類健康的主要疾病之一。目前針對(duì)乙肝的抗病毒治療藥物主要有核苷類似物及干擾素。這些藥物雖有一定療效，但也存在不良反應(yīng)，而且針對(duì)核苷類似物的耐藥性也逐漸增加。因此，新型抗HBV藥物的研究具有更重要的意義。

NO在體內(nèi)主要是由L-精氨酸在一氧化氮合酶(NOS)的催化下產(chǎn)生的一種氣態(tài)自由基，具有維持血管張力的恒定、調(diào)節(jié)血壓穩(wěn)定及腦血流、促進(jìn)記憶過程、殺傷細(xì)菌病毒及腫瘤細(xì)胞等多種生物學(xué)功能。早在十多年前Reiss CS等[3]就總結(jié)了NO能夠抑制多種病毒的復(fù)制，包括：脊髓灰質(zhì)炎病毒、小鼠肝炎病毒、流感病毒、水皰性口炎病毒、單純皰疹病毒(Ⅰ型)、EB病毒、獲得性免疫缺陷病毒(HIV)以及HBV等等。

JS-K作為NO供體藥物，它能在谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)作用下釋放定量的NO，以在腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)的GSTs為靶點(diǎn)，與GSTs結(jié)合，抑制GSTs的活性，在靶細(xì)胞中釋放NO而發(fā)揮殺細(xì)胞效應(yīng)，因此目前其研究主要集中于抗腫瘤方面，如：肝癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞以及肺癌細(xì)胞等[4-13]。對(duì)于腫瘤細(xì)胞，JS-K主要產(chǎn)生兩方面的作用：一方面釋放NO，直接殺滅腫瘤細(xì)胞；另一方面，JS-K在細(xì)胞內(nèi)耗竭GSH與GST，從而削弱細(xì)胞對(duì)化療藥物的外排作用。

有關(guān)JS-K在病毒性疾病中的研究尚未見報(bào)道。本研究首次發(fā)現(xiàn)了JS-K有潛在抗HBV的作用：它能在細(xì)胞中產(chǎn)生NO，引起HBsAg和HBeAg的分泌減少，尤其是對(duì)HBsAg的抑制?，F(xiàn)有研究認(rèn)為NO抑制病毒復(fù)制的機(jī)制主要集中于：一方面NO能夠影響含鐵和巰基的蛋白的功能，如：鳥苷酸環(huán)化酶、核苷酸還原酶、順烏頭酸酶和線粒體電子傳遞酶等[14]，使酶活性受到抑制，從而阻斷了細(xì)胞內(nèi)能量和DNA的合成，引起細(xì)胞毒性效應(yīng)，抑制病毒增殖；另一方面，NO能與超氧陰離子(O2-)作用生成具有強(qiáng)氧化作用的過氧化亞硝基陰離子ONOO-，它能氧化酶與蛋白質(zhì)等，使之硝基化并滅活酶活性，造成細(xì)胞代謝紊亂。

因此，從本研究結(jié)果看來，可推測(cè)JS-K抗HBV的效應(yīng)可能與JS-K和細(xì)胞內(nèi)GST結(jié)合后釋放NO有著重要關(guān)系，但釋放的NO抑制HBV相關(guān)抗原分泌的機(jī)制究竟是使病毒的RNA、DNA以及蛋白質(zhì)的合成受到抑制，還是使病毒的結(jié)構(gòu)蛋白被硝基化，又或者是其他什么原因，值得進(jìn)一步研究。

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[收稿2015-04-11;修回2015-05-27]

(編輯：譚秀榮)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

Experimental study of nitric oxide prodrug JS-K on inhibiting HBsAg and HBeAg in vitro

WangHuan1,2,ZhouYanmeng2,GouYing2,LiuZhengyun3,HuiJing1,LiuJie3

(1.Research Center for Medicine & Biology，Zunyi Guizhou 563099, China ;2.Department of Microbiology，Zunyi Guizhou 563099, China;3.Key Lab for Basic Pharmacology of Ministry of Education，Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099,China )

[Abstract]Objective To test the effect of nitric oxide prodrug JS-K in vitro against HBsAg and HBeAg. Methods HepG2.2.15 Cells with the HBV Gene were used to detect the cytotoxic effect of JS-K (0，1，2，5，10 μM) in killing HBV-containing cells.The release of NO after JS-K was determined by fluorescent staining; the expression of HBsAg and HBeAg was examined by ELISA and immunofluorescence combined with confocal laser scanning.Results Under the concentration of 10 μM, JS-K have no obvious toxic action on cells (P﹥0.05);When the concentration of JS-K was increased, the expression of HBsAg was decreased and the expression of HBeAg was also reduced.Conclusion Nitric oxide prodrug JS-K has the inhibitory activity on HBV antigen in vitro.

[Key words]nitric oxide;JS-K;hepatitis B virus

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼][中圖法分類號(hào)] R575.1 A

[文章編號(hào)]1000-2715(2015)03-0226-04

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：81360261)；貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(NO：黔科合J字LKZ[2013]08)；遵義醫(yī)學(xué)院博士啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(NO：F-578)。