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皮膚鱗狀細胞癌皮損中p-Akt，p-Stat3，CyclinD1的表達及意義

雷微1，陳永艷1，袁偉1，但翠娟2，李路3，沈孟奇1

(1.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 皮膚科，貴州 遵義563099；2. 寧波市婦女兒童醫(yī)院 皮膚科，浙江 寧波315016;3.貴州省航天醫(yī)院 皮膚科，貴州 遵義563000)

[摘要]目的 檢測磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化細胞信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄活化因子3(p-Stat3)、細胞周期蛋白D1(CyclinD1)在皮膚鱗狀細胞癌中的表達。方法 采用免疫組化SP方法檢測20例皮膚鱗狀細胞癌(SCC)和10例正常人皮膚組織中p-Akt, p-Stat3和CyclinD1蛋白的表達水平，利用圖像分析技術(shù)測量細胞陽性表達的平均光密度值，并分析三種蛋白表達的相關(guān)性。結(jié)果 SCC組中p-Akt、p-Stat3和CyclinD1的平均光密度值均明顯高于正常皮膚(NOM)組(P<0.01)；p-Stat3、CyclinD1蛋白的表達與SCC不同分化程度和浸潤深度有關(guān)(P<0.05)，p-Akt在SCC不同分化程度和浸潤深度的組織中表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；p-Akt與CyclinD1的表達，p-Stat3與CyclinD1的表達及p-Stat3與p-Akt的表達呈正相關(guān)(r=0.551, 0.502, 0.698, P<0.05)。結(jié)論 ①SCC中存在p-Akt、p-Stat3和CyclinD1蛋白的高表達，三者可能在SCC的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用；②p-Stat3在SCC中的表達強度與腫瘤的分化程度和浸潤深度有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]皮膚鱗狀細胞癌；磷酸化蛋白激酶B；磷酸化細胞信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄活化因子3；細胞周期蛋白D1

細胞信號轉(zhuǎn)導異常是導致細胞癌變的重要因素，信號轉(zhuǎn)導途徑將異常生長、增殖、分化信號傳至細胞而導致癌變。原癌基因蛋白激酶B(Protein kinase, PKB/Akt)及細胞信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄活化因子3(signal transducers and activators of transcription3, Stat3)，分別是PI3K/Akt和JAK/Stat3兩條細胞信號轉(zhuǎn)導途徑中的重要成員，細胞周期蛋白D1(cyclicproteinD1, CyclinD1)是PI3K/Akt和JAK/Stat3信號轉(zhuǎn)導途徑的下游靶基因，其異常表達可加速細胞周期循環(huán)過程，導致細胞持續(xù)異常分化、增殖而使細胞發(fā)生癌變。本實驗采用免疫組織化學SP法檢測p-Akt、p-Stat3和CyclinD1蛋白在皮膚鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma SCC)中的表達，并對這幾種蛋白的表達作相關(guān)性分析，探討其在SCC發(fā)生、發(fā)展中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1標本來源石蠟標本均來自我院2001～2011年皮膚科病理室經(jīng)組織病理確診的門診及住院病例。皮膚鱗狀細胞癌20例，男性10例，女性10例；年齡38～85歲，平均65.1歲；病程1月～20年，平均病程3.3年；取材部位：頭、面、四肢、軀干。根據(jù)Broders提出的病理分級法[1]將20例SCC分為：Ⅰ級6例，Ⅱ級7例，Ⅲ級7例；根據(jù)不同浸潤深度分為：真皮內(nèi) 14例 皮下組織 6例；20例患者均未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。正常皮膚組織來自我院手術(shù)室外科整形手術(shù)切除多余的皮膚，其中6例男性，4例女性，年齡10～66歲，平均38歲。

1.2主要試劑p-Akt(Ser473)兔多克隆抗體和p-Stat3(Tyr705)兔多克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，工作濃度均為1∶100。CyclinD1研究試劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,工作濃度均為1∶50。

1.3免疫組化SP法切片常規(guī)脫蠟至水，抗原復性液高溫法修復抗原(p-Akt 采用微波修復；p-Stat3、CyclinD1均采用高壓修復)，操作步驟按試劑盒說明書進行，經(jīng)DAB顯色，蘇木素復染，脫水干燥、透明、中性樹膠封片。以乳腺癌石蠟切片作為陽性對照，以PBS液代替一抗為陰性對照。

1.4結(jié)果判定由2位病理科醫(yī)生在獨立情況下對免疫組化結(jié)果進行評估。p-Akt為細胞漿出現(xiàn)棕黃色和(或)棕褐色顆粒為陽性表達；p-Stat3為細胞核出現(xiàn)棕黃色和(或)棕褐色顆粒為陽性表達；CyclinD1為細胞核出現(xiàn)棕黃色和(或)棕褐色顆粒為陽性表達。每張組織切片應用Image-Pro Plus6.0彩色分析系統(tǒng)在200倍視野下隨機選取表皮中5個陽性表達區(qū)域，測量細胞陽性表達的平均光密度值，取每個組織標本的p-Akt、p-Stat3、CyclinD1蛋白的平均值作為相對量進行定量分析。

2結(jié)果

2.1p-Akt、p-Stat3、CyclinD1的表達(見表1)p-Akt在SCC組中陽性染色可見于腫瘤細胞的細胞漿； NOM組中無p-Akt的陽性表達(見圖1、2)。p-Stat3在SCC組中陽性染色見于腫瘤細胞的細胞核；NOM組中呈陰性表達(見圖3、4)。CyclinD1在SCC組中的陽性染色見于腫瘤細胞的細胞核；NOM組中疑似少量CyclinD1弱陽性表達見于表皮基底細胞層(見圖5、6)。

組別例數(shù)p-Aktp-Stat3CyclinD1SCCNOM20100.118±0.0150a0.159±0.0180a0.212±0.0250.049±0.020a

aP<0.01, vs. SCC。

2.2p-Akt、p-Stat3與CyclinD1在不同分化程度及浸潤深度組織中陽性表達見表2，p-Stat3、CyclinD1蛋白的陽性表達在Ⅰ級與Ⅱ-Ⅲ級組中比較差異均具有統(tǒng)計學意義(tp-Stat3=-3.752,tCyclinD1=-3.119,P<0.05)，而p-Akt在兩組間的陽性表達比較差異無統(tǒng)計學意義(tp-Akt=-1.138,P>0.05)。p-Stat3和CyclinD1在局限于真皮內(nèi)和浸潤至皮下組織兩組之間的陽性表達比較差異有統(tǒng)計學意義(tp-Stat3=-2.536,tCyclinD1=

-2.456,P<0.05)，而p-Akt在不同浸潤深度組織間的陽性表達比較差異無統(tǒng)計學意義(tp-Akt=0.610,P>0.05)。

2.3p-Akt、p-Stat3、CyclinD1三者表達的相關(guān)性p-Akt與CyclinD1在SCC中的表達呈正相關(guān)(r=0.551,P<0.05)；p-Stat3與CyclinD1在SCC中的表達呈正相關(guān)(r=0.502,P<0.05)；p-Stat3與p-Akt在SCC中的表達呈正相關(guān)(r=0.698,P<0.05)。

組別例數(shù)p-Aktp-Stat3CyclinD1分化程度Ⅰ級60.091±0.0200.090±0.029a0.082±0.037aⅡ-Ⅲ級140.129±0.0200.198±0.0190.245±0.024浸潤深度真皮內(nèi)140.125±0.0160.093±0.032b0.175±0.027b皮下組織60.101±0.0370.187±0.0190.298±0.042

與Ⅱ-Ⅲ級比較，aP<0.05 ; 與皮下組織比較，bP<0.05。

3討論

皮膚鱗狀細胞癌(SCC)是一種增殖較快，發(fā)生于表皮和(或)附屬器角朊細胞的惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升，對人類健康造成嚴重危害，但其發(fā)病的確切分子機制并不完全清楚。大量研究表明腫瘤細胞失控性持續(xù)增殖是皮膚腫瘤同其他腫瘤一樣具有的特性，皮膚腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細胞信號的傳導異常密切相關(guān)。腫瘤的惡性行為通過觀察腫瘤細胞的分化程度來判斷，惡性程度越高，分化越低，浸潤轉(zhuǎn)移越容易，預后也越差。

Akt是一種存在于人類染色體中的癌基因，作為磷脂酰肌醇-3羥基激酶 (PI3K)下游關(guān)鍵效應分子，受生長因子刺激后磷酸化的PI3K使Akt的構(gòu)象改變，磷酸化其重要的2個結(jié)合位點(Ser473、Thr308)，進而通過滅活多種凋亡效應分子、調(diào)控細胞周期、激活端粒酶活性、促進血管生成和遷移相關(guān)程序等途徑而促進腫瘤的生長和侵襲[2]。Russo AE等[3]研究發(fā)現(xiàn)，黑素瘤的發(fā)生機制是由于PI3K/Akt信號系統(tǒng)的Akt激活，進而激活Akt下游的一系列靶基因，導致細胞分化、衰老異常、細胞異常增殖及惡性轉(zhuǎn)化。本實驗結(jié)果顯示p-Akt蛋白在SCC組織中呈高表達，與NOM組織比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，推測p-Akt蛋白表達水平的高低可能與SCC的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。我們進一步研究發(fā)現(xiàn)p-Akt蛋白在SCC不同分化程度和不同浸潤深度中陽性表達的比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，這一結(jié)果與Richter P等[4]研究發(fā)現(xiàn)隨著口腔鱗癌的惡性程度的加深，p-Akt蛋白染色顯著增強的結(jié)果不完全一致，可能與本實驗樣本量少有關(guān)，以后我們將加大樣本量進一步探討Akt信號轉(zhuǎn)導途徑是否也參與SCC的侵襲性發(fā)展。

Stat3作為Stats家族中被認定的癌基因之一，許多研究證實在多種惡性腫瘤組織和細胞中發(fā)現(xiàn)Stat3異常持續(xù)活化。細胞處于靜息狀態(tài)時，Stat3主要分布于細胞漿中，當JAK蛋白酪氨酸激酶接受細胞外信號刺激后，Stat3的酪氨酸基團被磷酸化而激活成p-Stat3，形成的同源或異源二聚體遂轉(zhuǎn)位入核并誘導調(diào)控其下游與細胞增殖、分化、凋亡密切相關(guān)的基因異常高表達進而表現(xiàn)出致癌作用。在皮膚血管肉瘤、Kaposi's 肉瘤中均發(fā)現(xiàn)p-Stat3呈高表達狀態(tài)[5-6]。我們研究發(fā)現(xiàn)p-Stat3蛋白在SCC組織中的表達高于NOM組織，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；p-Stat3蛋白在SCC不同分化程度和浸潤深度中陽性表達的比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，這與趙洪春等[7]研究結(jié)果一致 ，提示p-Stat3蛋白的過度表達可能與SCC的發(fā)生及惡性生物行為密切相關(guān)。

CyclinD1作為細胞周期素(Cyclins)家族中重要的一員，在細胞周期進展過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。當接受細胞外信號刺激后CyclinD1呈異常表達狀態(tài)時，細胞增殖周期出現(xiàn)失控，腫瘤因而發(fā)生。作為p-Stat3、p-Akt的下游靶基因，CyclinD1參與PI3K/Akt和JAK/Stat3信號轉(zhuǎn)導途徑促進腫瘤形成和發(fā)展的過程。Leslie等[8]研究提示CyclinDl mRNA和蛋白在Stat3的活化調(diào)控下呈放大狀態(tài)，導致細胞惡性轉(zhuǎn)化。PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導途徑可通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、mRNA翻譯和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性等阻止CyclinD1降解，參與腫瘤發(fā)生[9]。本實驗結(jié)果顯示CyclinD1蛋白在SCC組織中的的表達高于NOM組織，并且與p-Akt、p-Stat3蛋白的表達呈正相關(guān)，提示p-Akt、p-Stat3可能分別通過PI3K/Akt和JAK/Stat3兩條信號轉(zhuǎn)導途徑誘導CyclinD1的過度表達，進而促進腫瘤細胞的生長及增殖，與本課題組前期在Paget病中的研究結(jié)果相一致[10]。

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[收稿2015-04-15;修回2015-05-20]

(編輯：王福軍)

臨床醫(yī)學研究

Expression of phosphorylated-Akt，phosphorylated-Stat3 and CyclinD1 in squamous cell carcinoma

LeiWei1,ChenYongyan1,YuanWei1,DanCuijuan2,LiLu3,ShenMengqi1

(1.Department of Dermatology,The Affiliate Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099,China;2.Department of Dermatology,Ningbo Women & Children's Hospital,Ningbo Zhejiang 315016,China;3.Department of Dermatology,Guizhou Aerospace Hospital,Zunyi Guizhou 563000,China)

[Abstract]Objective To investigate the significance of phosphorylated protein kinase B (p-Akt),phosphorylated signal transductor and activator of transcription3 (p-Stat3) and Cyclic proteinD1(CyclinD1) protein expression in the squamous cell carcinoma(SCC).Methods The expressions of p-Akt, p-Stat3 and CyclinD1 were detected by Immunohistochemistry in 20 cases of SCC and 10 cases of normal human skin tissues. The positive protein expressions of p-Akt, p-Stat3 and CyclinD1 were measured and quantified by Image analysis and the mean optical density was determined. These protein expressions and their relationship with the pathological factors were analyzed.Results The mean optical density of p-Akt, p-Stats3 and CyclinD1 protein were obviously higher in SCC group than those in normal skin (NOM) group (P<0.01).The expressions of p-Stat3 and CyclinD1 protein were correlated with the tumor differentiation degree and the depth of tumor invasion in SCC (P<0.05), but the expression of p-Akt didn’t differ (P>0.05). In SCC, positive correlation between expressions of p-Stat3 and CyclinD1, p-Akt and CyclinD1, p-Stat3 and p-Akt (r were 0.551, 0.502 and 0.698 respectively, P<0.05) were found.Conclusion 1)There were high-expressions of p-Akt, p-Stat3 and CyclinD1 in SCC, which may play an important role in the development of SCC. 2) The expression intensity of p-Stat3 was correlated with both the tumor differentiation degree and the depth of tumor invasion in SCC.

[Key words]squamous cell carcinoma; phosphorylated-Akt; phosphorylated-Stat3; CyclinD1

[文獻標志碼][中圖法分類號] R739.5 A

[文章編號]1000-2715(2015)03-0275-04

[基金項目]貴州省科學技術(shù)基金項目(NO:gzwkj2008-1-027)。

[通信作者]陳永艷，女，教授，碩士生導師，研究方向：皮膚分子生物學，E-mail:cyyzy@126.com。