賈　丹,陳嘯飛，丁　璇，朱臻宇,柴逸峰,張　川

[1.第二軍醫(yī)大學藥學院藥物分析學教研室，上海市藥物(中藥)代謝產(chǎn)物研究重點實驗室，上海 200433；2.第二軍醫(yī)大學藥學院中藥鑒定學教研室，上海 200433；3.第二軍醫(yī)大學藥學院，上海 200433；4.第二軍醫(yī)大學藥學院分析測試中心，上海 200433]

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·專家論壇·

制備色譜及其在藥物研究中的應用

賈丹1,2,陳嘯飛3，丁璇1，朱臻宇4,柴逸峰3,張川2*

[1.第二軍醫(yī)大學藥學院藥物分析學教研室，上海市藥物(中藥)代謝產(chǎn)物研究重點實驗室，上海 200433；2.第二軍醫(yī)大學藥學院中藥鑒定學教研室，上海 200433；3.第二軍醫(yī)大學藥學院，上海 200433；4.第二軍醫(yī)大學藥學院分析測試中心，上海 200433]

[摘要]制備色譜作為天然產(chǎn)物分離純化的有效手段，具有操作簡便、產(chǎn)品純度高、分離速度快等優(yōu)點。本文綜述了近年來液相制備色譜(高效液相制備色譜、高速逆流色譜、模擬移動床色譜、超臨界流體色譜)和氣相制備色譜的最新研究進展，以及不同制備色譜在藥物研究中的應用現(xiàn)狀和前景。

[關鍵詞]制備色譜；應用模式；藥物研究；綜述

[Pharm Care Res，2015，15(3): 161-165]

從20世紀初發(fā)展至今，色譜技術已由分析規(guī)模發(fā)展到制備和生產(chǎn)規(guī)模，在藥物研究尤其是活性成分的分離純化中發(fā)揮著越來越重要的作用。制備色譜并非分析色譜的簡單放大：分析型色譜是通過對目標產(chǎn)物進行定性或定量分析，獲取反映樣品組成的信息，無需收集特定組分；制備型色譜則是按一定純度要求，分離、富集或純化一定量的目標產(chǎn)物進行后續(xù)研究，需考慮目標產(chǎn)物的產(chǎn)率、純度等[1]。本文簡要介紹了制備色譜的類型、應用模式，并對其在藥物研究中的應用進行綜述。

1制備色譜的類型

1.1高效液相制備色譜液相制備色譜根據(jù)分離過程中的壓力分為低壓制備色譜(<0.5 MPa)、中壓制備色譜(0.5～2 MPa)和高壓制備色譜(>2 MPa)，其中高壓制備色譜又稱高效液相制備色譜(preparative high performance liquid chromatography, Pre-HPLC)，是利用更細粒徑的填料、高流速進行分離。根據(jù)分離樣品的負載量分為研究開發(fā)型和工業(yè)生產(chǎn)型。根據(jù)分離原理分為正相、反相、體積排阻及離子交換四種模式。

Pre-HPLC體系由控制系統(tǒng)、高壓輸液泵、自動進樣器、制備型色譜柱、檢測器及成分收集器等組成，其中制備色譜柱是核心，色譜填料的填裝方式是影響柱效的關鍵因素。Forssén等[2]研究了色譜柱(柱徑、柱長及柱型)、填料(種類、尺寸及裝填方法)、流動相(組成、流速)及樣品(性質(zhì)、上樣量)等影響液相制備色譜分離純化效率的因素，發(fā)現(xiàn)短柱、高壓可提高產(chǎn)率，而樣品濃度和柱效對最大產(chǎn)率的影響極微。

1.2高速逆流色譜高速逆流色譜(high-speed counter-current chromatography, HSCCC)是20世紀80年代發(fā)展起來的一種液液分配色譜技術，一相為固定相，另一相為流動相，在高速旋轉的分離管中，實現(xiàn)一種特殊的單向流體動力學平衡。物質(zhì)根據(jù)在兩相中分配系數(shù)不同實現(xiàn)分離，避免了不可逆吸附引起的樣品變性、失活等，而且由于被分離物質(zhì)與液態(tài)固定相之間能夠充分接觸，大大提高了樣品回收率。Li等[3]通過考察進樣量、分離時間、溶劑消耗量及產(chǎn)出量等參數(shù)，將逆流色譜與Pre-HPLC進行了比較，發(fā)現(xiàn)前者具有大進樣量(尤其是溶解度低的樣品)、低溶劑消耗量、高產(chǎn)率等優(yōu)點。

HSCCC體系主要由輸液泵、進樣閥、螺旋管式離心分離管、檢測器及餾分收集器等組成，影響其制備分離效率的因素主要有兩相溶劑體系的組成、組分的分配系數(shù)、洗脫模式、流速、溫度及相連檢測技術等，其中選擇恰當?shù)娜軇w系是HSCCC方法建立過程中最重要和最耗時的步驟[4]。

1.3模擬移動床色譜模擬移動床(simulated moving bed,SMB)色譜是20世紀60年代研制開發(fā)的一種現(xiàn)代化分離技術，是最適于連續(xù)性大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的色譜技術之一。它將模擬移動床的設計理念融入液相制備色譜中，實現(xiàn)了二者的結合，既保持了液相制備色譜分離純度高、消耗小、可變溫操作的優(yōu)點，又克服了其不能連續(xù)操作的缺點，具有分離效率高、固定相利用率高、自動化連續(xù)操作等優(yōu)點，尤其適于兩組分體系的分離。從20世紀90年代開始，出現(xiàn)了一些新型SMB操作方式，其中一種將化學反應和模擬移動床結合的技術——SMB色譜反應器被廣泛應用[5]。SMB通過變換固定床吸附設備物料進出口的位置，以逆流連續(xù)操作的方式，產(chǎn)生一種類似于物料連續(xù)向上、吸附劑連續(xù)向下移動的效果。通常利用特定的裝置(如旋轉閥)，使四個物料口以與固定相濃度變化相同的速度上移，從而形成一個閉合的回路，實現(xiàn)保持進出口位置不動、固定吸附劑在吸附器中自上而下移動的效果。

1.4超臨界流體色譜超臨界流體色譜(supercritical fluid chromatography,SFC)是20世紀60年代發(fā)展起來的一種以超臨界流體為流動相、以鍵合到載體上的高聚物為固定相的色譜技術，具有氣體黏度低、液體溶解能力強、擴散系數(shù)大等優(yōu)點，廣泛用于手性化合物的分離制備。Yan等[6]將SFC與其他制備色譜(HPLC、穩(wěn)態(tài)循環(huán)色譜、SMB色譜)進行了比較，發(fā)現(xiàn)其具有高效、高通量、低溶劑消耗量等優(yōu)勢。

SFC依據(jù)各組分在兩相間分配系數(shù)不同實現(xiàn)分離。超臨界CO2因低毒、溶解度及洗脫能力隨壓力升高而增大、可實現(xiàn)梯度洗脫等，成為制備型SFC中最常用的流動相[7]。對于中等極性物質(zhì)的分離，多數(shù)情況需添加少量的改性劑(甲醇、異丙醇等)，以增強流動相的洗脫能力，提高選擇性和分離效率。制備型SFC體系主要由高壓流動相輸送系統(tǒng)、色譜分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)及樣品收集系統(tǒng)組成。

1.5氣相制備色譜氣相制備色譜(preparative gas chromatography,pGC)是對上述制備色譜技術的一個補充，尤其適用于萜烯類及其他揮發(fā)性物質(zhì)的制備分離。根據(jù)固定相的狀態(tài)，分為氣-固色譜法和氣-液色譜法，分別依據(jù)物質(zhì)在兩相間的吸附系數(shù)和分配系數(shù)不同實現(xiàn)分離。pGC體系主要由載氣系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、色譜柱、分流裝置、檢測器及樣品收集系統(tǒng)組成，為獲得高純度的目標產(chǎn)物，在樣品收集系統(tǒng)中運用了可控閥門、閥切換等技術。Zuo等[8]對pGC的進樣裝置、色譜柱、分流系統(tǒng)、檢測器等進行了較為全面的介紹。

與其他制備色譜相比，pGC的應用還受到一定限制，除了受樣品性質(zhì)的約束，另外還有：(1)大體積氣相制備色譜柱需要的載氣量多且不可回收利用；(2)樣品進入色譜柱前必須被充分霧化；(3)從色譜柱流出的目標成分濃度低，很難實現(xiàn)高效率收集；(4)很難像液相制備色譜那樣，實現(xiàn)工業(yè)規(guī)模的自動化生產(chǎn)。

2制備色譜的應用模式

為滿足生物技術、醫(yī)藥化工等行業(yè)快速發(fā)展的需求，制備色譜的應用模式不只局限于單一技術的一維模式，還出現(xiàn)了幾種制備色譜技術的二維或多維聯(lián)用及不同技術間的融合模式。

2.1制備色譜的二維及多維模式二維或多維制備色譜通常是將分離機制不同的兩種或多種色譜系統(tǒng)結合起來，實現(xiàn)不同色譜技術間的補充。樣品經(jīng)過第一維系統(tǒng)被濃縮、富集之后，進一步被切換至第二維甚至三維系統(tǒng)，然后經(jīng)檢測器被分離收集。二維或多維系統(tǒng)通過不同的分離機制，使得樣品中的各成分依據(jù)不同的特性分離開來。在一維體系中不能完全分開的組分，在二維、三維甚至多維體系中可得到更好的分離。與單一的一維體系相比較，二維及多維體系具有分離能力強、分離效率高、產(chǎn)量高等優(yōu)勢。隨著色譜技術的發(fā)展，二維及多維制備色譜由離線發(fā)展到在線方式，使得一維中的洗脫物部分或全部在線、直接進入后續(xù)系統(tǒng)中進行制備分離。二維制備色譜系統(tǒng)的應用實例見表1。

三維或多維系統(tǒng)多由pGC組成，Sciarrone等[13]利用三維pGC及核磁共振/紅外/質(zhì)譜，從黃皮中快速收集了一種新物質(zhì)，制備量達毫克級，鑒定為(2E，6E)-2-甲基-6-(4-甲基環(huán)-3-亞丙烯基)庚-2-烯醛。另外，其課題組通過正相液相色譜及GC建立了一個四維系統(tǒng)[14]，從香根草精油中分離出兩種含量極低的組分，純度高達90%，彌補了液相制備色譜分離能力弱,及pGC載樣量低的缺點。

表1　二維制備色譜系統(tǒng)的應用

2.2不同制備色譜技術的融合模式目前應用較多的是超臨界流體及SMB色譜與其他色譜技術的融合。Denet等[15]對超臨界模擬移動床色譜分離技術進行了研究；Gomes等[16]利用氣相模擬移動床色譜分離了丙烷、丙烯混合物，純度和回收率分別高達99.5%和99.0%；Cristancho等[17]采用超臨界流體-模擬移動床色譜分離了亞油酸乙酯和油酸乙酯；Cao等[18]通過超臨界流體-HSCCC實現(xiàn)了葡萄籽油及葡萄籽脫脂油的生產(chǎn)。

3制備色譜在藥物研究中的應用

3.1在中藥及天然產(chǎn)物研究中的應用天然產(chǎn)物是活性藥物成分的重要來源，從中尋找先導化合物并進行結構修飾是新藥研發(fā)的熱點。中藥是我國傳統(tǒng)的寶貴資源，其種類繁多、成分復雜、性質(zhì)各異，如何將有效成分分離純化后進行藥理藥效研究是中藥現(xiàn)代化的關鍵問題之一。制備色譜技術作為天然產(chǎn)物分離純化的有效手段，快速簡便、產(chǎn)品純度高。

Liu等[19]采用離子液體為HSCCC的改性劑，從木蝴蝶中分離制備出黃芩素-7-O-二葡萄糖苷和黃芩素-7-O-葡萄糖苷，產(chǎn)率和純度分別為30.3%、50.4%和98.7%、99.1%。許青青等[20]采用SMB色譜分離純化了藥物中間體鏈甾醇，產(chǎn)率和純度分別高達93.8%、98.9%。Wang等[21]利用中壓液相色譜、HSCCC及Pre-HPLC從榕樹葉中分離純化出四種黃酮C-糖苷，純度均>92%。另外，某些制備色譜因達到一定的產(chǎn)率和純度要求，已用于對照品的制備。廖茂梁等[22]利用中低壓制備色譜建立了從枳實中分離制備柚皮苷和新橙皮苷對照品的方法，質(zhì)量分數(shù)分別高達98.76%和99.50%。李小艷等[23]通過中低壓正相色譜及高壓反相色譜建立了從澤瀉中快速高效制備23-乙酰澤瀉醇B對照品的方法，每次可從2 g澤瀉乙酸乙酯粗提物中分離出40.2 mg 23-乙酰澤瀉醇B。

3.2在手性藥物研究中的應用手性藥物廣泛存在于天然和半合成藥物中，在全合成藥物中占到了40%。維持生命活動的生物大分子(如蛋白質(zhì)、核酸等)也幾乎全是手性的，二者之間通過嚴格手性匹配與分子識別產(chǎn)生相互作用。手性藥物對映體的藥理活性、代謝過程及毒性存在顯著差異，往往兩種異構體中僅有一種是有效的，另一種無效甚至有害。因此，如何將兩種對映體快速高效地分離開來是手性藥物研究中的關鍵問題之一。SFC、SMB色譜等制備色譜技術在對映體的分離純化中具有獨特的優(yōu)勢，且后者已被國際上公認為拆分手性藥物的最有效手段。Li等[24]通過HSCCC從紅花中分離純化了4種香豆精胺類似物順反異構體，純度均>95%。孫玉高等[25]利用平衡擴散模型對酮洛芬對映體在4區(qū)SMB上的拆分進行模擬研究，對其試生產(chǎn)具有一定的指導意義。Zuo等[26]通過pGC從石菖蒲中分離了順反細辛腦。

3.3在藥物代謝產(chǎn)物研究中的應用藥物代謝是影響其發(fā)揮藥效及產(chǎn)生毒性的過程，獲得藥物代謝方式、途徑等信息，有助于藥物的研究和臨床合理用藥。FDA明確要求，新藥上市時不僅要明確其體內(nèi)代謝動力學特征，還需明確它們的代謝產(chǎn)物。當樣品濃度較高或檢測方法具有足夠的靈敏度時，樣品經(jīng)常規(guī)前處理后即可直接測定；但當藥物濃度較低或分析方法的特異性或靈敏度較差時，樣品需進行分離、純化或濃集后測定。因此，代謝產(chǎn)物的分離純化是藥物研究中的關鍵問題之一，高通量藥物的吸收、分布、代謝及排泄性質(zhì)篩選需要匹配高效、高靈敏度及低耗費的分離純化技術。制備色譜的快速高效性是其他分離技術無法比擬的，在藥物代謝產(chǎn)物的研究中具有一定的應用前景。

Hsieh等[27]通過SFC及大氣壓化學離子質(zhì)譜進行了氯氮平等藥物的體外代謝穩(wěn)定性實驗，準確度高、精密度好、快速高效。Dear等[28]通過Pre-HPLC及超低溫核磁共振光譜建立了人血漿中藥物代謝物的檢測方法，實現(xiàn)了對一種濃度低至10 ng/ml的新代謝物的定性定量分析。

3.4在靶標蛋白質(zhì)等研究中的應用制備色譜技術還用于藥物靶標蛋白質(zhì)、酶等生物活性大分子的研究。Sun等[29]介紹了制備色譜技術在蛋白質(zhì)分離純化中的應用，Mangas等[30]通過Pre-HPLC分離純化了大腦中有機磷化合物的靶標膽堿酯酶。

4結語

經(jīng)典柱層析色譜法雖可用于大量樣品的處理，但效率低、費時且消耗溶劑量大；制備薄層層析法簡便，但處理樣品量有一定局限。而制備色譜技術因柱效高、分離速度快等特點，不論在基礎研究中的富集性分離，還是在工業(yè)上規(guī)?；a(chǎn)中，都是分離純化天然產(chǎn)物及化學合成產(chǎn)物的有效技術手段，在醫(yī)藥、食品、精細化工等行業(yè)具有廣闊的發(fā)展和應用前景。同時也應該認識到，不同的制備色譜技術具有不同的優(yōu)缺點，使用時需根據(jù)目標組分的性質(zhì)和特點進行選擇。二維或多維制備色譜技術聯(lián)用及不同技術間的融合模式，既在一定程度上結合了不同技術的優(yōu)點又彌補各自的不足，是一種很好的選擇。

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[修回日期]2015-05-18

[本文編輯]陽凌燕

Preparative chromatography and its applications in drug research

JIA Dan1,2,CHEN XiaoFei3,DING Xuan1,ZHU ZhenYu4,CHAI YiFeng3,ZHANG Chuan2*

[1.Department of Pharmaceutical Analysis, School of Pharmacy, Second Military Medical University，Shanghai Key Laboratory for Pharmaceutical(Chinese Materia Medica) Metabolites Research,Shanghai 200433,China;2.Department of Authentication of Chinese Medicine,School of Pharmacy,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China;3.School of Pharmacy,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China;4.Pharmaceutical Analysis Center,School of Pharmacy,Second Military Medical University, Shanghai 200433,China]

[ABSTRACT]As an effective technology, preparative chromatography has shown greater convenience, higher purity and speed in separation and purification of active ingredients from natural products. This article briefly described the most recently research progress in preparative liquid chromatography (including preparative high performance liquid chromatography, high-speed counter-current chromatography, simulated moving bed chromatography and supercritical fluid chromatography) and preparative gas chromatography, the proposed progresses and encouraging prospects in drug research were also reviewed.

[KEY WORDS]preparative chromatography;application mode;drug research；review

[收稿日期]2014-11-25

DOI：10.5428/pcar20150301

[中圖分類號]R917

[文獻標志碼]A

[文章編號]1671-2838(2015)03-0161-05

作者簡介賈丹(女),碩士生.E-mail:jiadanjiayou91@sina.com*通信作者(Corresponding author)：張川,E-mail:zhangchuan@smmu.edu.cn