石　沖　張國彬　張宇新　張作鳳

(唐山市婦幼保健院遺傳生殖科，河北　唐山　063000)

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磷酸化ERK1/2對帕金森病模型小鼠黑質(zhì)半胱氨酸蛋白酶-3表達(dá)的影響

石沖張國彬1張宇新1張作鳳1

(唐山市婦幼保健院遺傳生殖科，河北唐山063000)

摘要〔〕目的研究磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)對1-甲基-4-苯基-1，2，3，6四氫吡啶(MPTP)所致帕金森病(PD)模型小鼠黑質(zhì)中半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3的調(diào)控作用。方法建立PD小鼠模型，觀察小鼠行為學(xué)變化；免疫組化和免疫印跡法檢測黑質(zhì)酪氨酸羥化酶(TH)、caspase-3和p-ERK1/2的陽性細(xì)胞數(shù)和蛋白表達(dá)水平以及caspase-3酶活性改變，并觀察給予p-ERK1/2特異性抑制劑U0126對上述變化的影響。結(jié)果與對照組相比，模型小鼠出現(xiàn)典型PD癥狀,TH蛋白水平下降約28.2%(P=0.009)，p-ERK1/2、caspase-3陽性細(xì)胞及蛋白水平顯著增加(P<0.01)；經(jīng)ERK1/2抑制劑U0126處理后，上述變化均顯著減輕(P<0.01)。結(jié)論P(yáng)-ERK1/2對MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠黑質(zhì)caspase-3表達(dá)可能有調(diào)控作用，U0126對PD小鼠具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞〔〕帕金森??；MPTP；磷酸化ERK1/2；半胱氨酸蛋白酶-3；U0126

1河北聯(lián)合大學(xué)研究生學(xué)院

第一作者：石沖(1981-)，女，主治醫(yī)師，博士，主要從事神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制研究。

帕金森病(PD)的病理特征為中腦黑質(zhì)多巴胺(DA)能神經(jīng)元進(jìn)行性變性丟失，具體發(fā)病機(jī)制尚未明確〔1〕。研究表明PD病人和模型動(dòng)物黑質(zhì)區(qū)可見caspase-3激活介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡〔2，3〕，PD小鼠敲除caspase-3基因明顯減少黑質(zhì)區(qū)DA能神經(jīng)元丟失〔4〕，提示caspase-3在PD發(fā)病過程中可能起重要作用。闡述caspase-3的表達(dá)調(diào)控，利于揭示PD的發(fā)病機(jī)制。研究表明p-ERK1/2調(diào)控caspase-3激活〔5,6〕，類似機(jī)制是否存在于1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氫吡啶(MPTP)誘導(dǎo)PD模型小鼠DA能神經(jīng)元丟失進(jìn)程還不清楚。本實(shí)驗(yàn)觀察PD小鼠模型中p-ERK1/2對中腦黑質(zhì)區(qū)caspase-3表達(dá)和活性的影響，為PD的機(jī)制研究提供新思路。

1材料和方法

1.1動(dòng)物采用北京維通利華公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心C57BL/6N雄性小鼠30只，8～12周齡，25～30 g。自然光照，室溫(25±2)℃，小鼠自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)環(huán)境1 w后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所有動(dòng)物操作均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)的有關(guān)規(guī)定。

1.2試劑MPTP(美國Sigma公司)，兔抗人caspase-3 mAb(福州邁新生物)，小鼠抗人TH mAb(美國Chemicon公司)，鼠抗人p-ERK mAb(美國Santa cruz公司)，p-ERK抑制劑U0126(德國Merk公司)，caspase-3熒光底物Ac-DEVD-AMC(美國Chemicon公司)，兔/鼠SP超敏試劑盒(福州邁新生物)。

1.3儀器設(shè)備組織切片機(jī)(Leitz 1512型，德國Leitz公司)，OLYMPUS光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，電子天平(JA-2003型，上海天平儀器廠)，低溫離心機(jī)(TGL-16G-A型，上海安亭科學(xué)儀器廠)，圖像分析系統(tǒng)(CMIAS，北京航空航天大學(xué))，電泳儀(DYY-TB型，北京六一儀器廠)，半干式碳板轉(zhuǎn)移電泳槽(DYY-Ⅲ40C型，北京六一儀器廠)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法〔7〕

1.4.1動(dòng)物分組小鼠隨機(jī)分成三組，每組10次，模型組：0.3%MPTP(30 mg/kg)生理鹽水配制并腹腔注射，1次/d。U0126組：MPTP注射前3 d腹腔預(yù)注射U0126(5 mg/kg,ip)，1次/d，連續(xù)3 d，每天注射MPTP前2～3 h注射1次U0126。對照組：注射與模型組等體積的生理鹽水。注射藥物后觀察小鼠行為變化。各組均于第5次MPTP注射后6 h取腦。

1.4.2免疫組化MPTP第5次注射后6 h麻醉小鼠，經(jīng)固定后每只小鼠取中腦3個(gè)相同斷面行免疫組化染色。切片脫蠟后水浴法熱修復(fù)，然后30 ml/L過氧化氫阻斷內(nèi)源過氧化物酶，非免疫動(dòng)物血清室溫孵育10 min。分別加入鼠抗人p-ERK1/2 mAb(1∶100)，兔抗人caspase-3 mAb(1∶100)4℃過夜。二抗室溫孵育30 min，最后DAB顯色并拍照分析。

1.4.3免疫印跡麻醉小鼠迅速斷頭取腦并分離中腦黑質(zhì)，低溫勻漿后靜置30 min，高速離心后取上清備用。蛋白定量并在95℃水浴變性5 min。樣品凝膠電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，加入TH 單抗(1∶1 000)、caspase-3單抗(1∶400)和p-ERK1/2 單抗(1∶300)4℃過夜?？寡?1∶200)室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光并曝光，掃描結(jié)果使用Image J軟件。

1.4.4caspase-3酶活性測定模型制作成功后裂解組織提取蛋白并測蛋白濃度,調(diào)節(jié)蛋白濃度為1 μg/μl。100 μl體系中加入caspase-3特異性熒光底物Ac-DEVD-AMC，37℃避光孵育1 h。酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度，激發(fā)光波長360 nm，發(fā)射光波長為460 nm。重復(fù)3孔并記錄結(jié)果。

1.5圖像分析免疫組化切片在CMIAS真彩色醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)10×物鏡下定位，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，每張腦片6個(gè)部位并計(jì)算均值。Image J軟件分析平均光密度值以比較各組Western印跡蛋白的表達(dá)。

2結(jié)果

2.1行為學(xué)觀察30只小鼠無死亡，均納入結(jié)果分析。模型組小鼠MPTP注射后約20 min出現(xiàn)豎毛、尾過伸上翹、陣發(fā)性軀干震顫、易激惹、小便失禁、步態(tài)蹣跚等短暫的行為反應(yīng)，隨后出現(xiàn)自發(fā)性活動(dòng)明顯減少，次日略見恢復(fù)；U0126組小鼠與模型組相比PD特異性癥狀有所減輕。對照組小鼠活動(dòng)一切如常。

2.2黑質(zhì)區(qū)caspase-3及p-ERK免疫組化結(jié)果對照組偶見caspase-3陽性細(xì)胞，胞質(zhì)著色淺；MPTP5次注射后6 h，caspase-3陽性細(xì)胞胞質(zhì)著色很深。與模型組相比，U0126組陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且胞質(zhì)著色略變淺(P<0.01)。對照組僅見少量p-ERK胞質(zhì)淺著色細(xì)胞；模型組6 h胞質(zhì)、胞核均呈黃褐色p-ERK少量陽性細(xì)胞；與模型組相比，U0126組僅見細(xì)胞核染黃褐色，胞質(zhì)著色略淺(P<0.01)。見圖1，表1。

圖1　中腦黑質(zhì)區(qū)p-ERK1/2,caspase-3免疫組化染色(×200)

組別p-ERK1/2caspase-3對照組14.50±2.0710.83±2.64模型組54.33±3.931)45.67±1.511)U0126組29.50±1.872)32.50±2.432)

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05，下表同

2.3Western印跡檢測TH、caspase-3、p-ERK1/2蛋白結(jié)果分子量約Marker 61 000處,可見TH特異性蛋白條帶。與對照組相比，MPTP模型組TH蛋白表達(dá)明顯降約28.2%(P=0.009)。分子量約33 000處可見caspase-3特異性蛋白條帶，模型組蛋白條帶著色最深，U0126組同時(shí)間點(diǎn)與模型組相比條帶較窄，染色較淺。經(jīng)圖像分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。對照組在約44 000和42 000分子量處可見p-ERK1/2特異性窄淺清晰蛋白條帶，模型組蛋白條帶著色略深，U0126組與模型組相比蛋白條帶略淺。差異顯著(P=0.002)，見圖2，表2。

圖2　中腦黑質(zhì)區(qū)磷酸化p-ERK1/2、caspase-3 Western印跡結(jié)果

組別p-ERK1/2caspase-3TH對照組0.77±0.01540.61±0.0030.53±0.009模型組0.99±0.0031)0.99±0.0081)0.41±0.0111)U0126組0.84±0.0062)0.74±0.0072)0.47±0.0052)

2.4caspase-3酶活性結(jié)果模型組MPTP誘導(dǎo)的caspase-3酶活性極大增強(qiáng)(0.004 pmd/min)，使用p-ERK1/2上游激酶特異性抑制劑U0126后caspase-3活性有所抑制(0.003 pmol/min，P<0.05)。

3討論

PD發(fā)病的臨床表現(xiàn)有靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、姿勢不穩(wěn)、肌強(qiáng)直和步態(tài)障礙，病理特征為中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元進(jìn)行性變性缺失。本實(shí)驗(yàn)MPTP注射后小鼠出現(xiàn)震顫、豎毛、翹尾、活動(dòng)減少等行為學(xué)特征，黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元丟失嚴(yán)重〔7〕，提示PD模型成功復(fù)制。

研究表明PD發(fā)病與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切〔8～11〕，凋亡途徑中細(xì)胞膜表面的凋亡受體激活caspase-8，進(jìn)而激活凋亡的最終執(zhí)行者caspase-3。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒MMPTP注射后黑質(zhì)區(qū)出現(xiàn)大量caspase-3陽性細(xì)胞，其蛋白表達(dá)及caspase-3酶活性也明顯升高，同時(shí)伴有黑質(zhì)TH蛋白表達(dá)水平降低，提示caspase-3參與的凋亡反應(yīng)可能是DA能神經(jīng)元變性丟失的關(guān)鍵。

PD的發(fā)生發(fā)展涉及細(xì)胞內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。MAPK家族的主要成員ERK1/2是一種位于胞漿的蛋白激酶，一旦被激活,ERK1/2迅速穿過核膜并通過磷酸化反應(yīng)調(diào)節(jié)某些轉(zhuǎn)錄因子的活性引起特定蛋白的表達(dá)或活性改變,最終影響細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)〔12〕。研究證實(shí)p-ERK1/2上游激酶特異性抑制劑可抑制Thrombin誘導(dǎo)的中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元caspase-3表達(dá)〔5〕，提示caspase-3可能受p-ERK1/2調(diào)控。因此本實(shí)驗(yàn)分析了p-ERK1/2、caspase-3和TH在MPTP所致PD模型小鼠黑質(zhì)區(qū)的表達(dá)情況，免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組6 h p-ERK1/2出現(xiàn)明顯核轉(zhuǎn)位，而caspase-3此時(shí)有顯著表達(dá)。U0126是ERK1/2信號(hào)通路的特異性抑制劑，研究表明它具有神經(jīng)保護(hù)作用〔13〕。

本研究認(rèn)為，MPTP可誘導(dǎo)中腦黑質(zhì)p-ERK1/2分子激活，啟動(dòng)了caspase-3表達(dá)及凋亡反應(yīng),最終導(dǎo)致DA能神經(jīng)元變性丟失；抑制劑U0126阻斷了p-ERK1/2活化，使caspase-3表達(dá)減少，最終減輕了MPTP介導(dǎo)的DA能神經(jīng)元損傷?？傊琈PTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型中，p-ERK1/2可能調(diào)控caspase-3表達(dá)，而抑制p-ERK1/2通路對DA能神經(jīng)元可能具有神經(jīng)保護(hù)作用。

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〔2014-06-19修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

中圖分類號(hào)〔〕R745.7〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)24-7046-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.035