張　磊　王彥永　劉　佳　于　靜　楊樹民

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科，河北　石家莊　050031)

?

豨薟草提取液對(duì)MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

張磊王彥永1劉佳2于靜楊樹民

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科，河北石家莊050031)

摘要〔〕目的探討豨薟草提取液對(duì)1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)誘導(dǎo)的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12細(xì)胞)損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。方法在生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PC12細(xì)胞中加入終濃度為400 μmol/L的MPP+，造成帕金森病(PD)的離體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停⒂^察豨薟草提取液對(duì)MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，通過DCFH-DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平。結(jié)果400 μmol/L MPP+作用PC12細(xì)胞能明顯抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，造成細(xì)胞發(fā)生損傷，ROS水平增加。同時(shí)給予不同濃度豨薟草提取液，PC12細(xì)胞存活率明顯增加，ROS水平顯著降低。結(jié)論豨薟草提取液能有效改善MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的損傷，其作用機(jī)制可能與降低ROS水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕帕金森?。回g薟草；1-甲基-4-苯基吡啶離子；PC12細(xì)胞；活性氧

1河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院神內(nèi)科2河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科

第一作者：張磊(1979-)，男，主管藥師，主要從事臨床藥理學(xué)研究。

帕金森病(PD)是發(fā)生在中老年期的一種常見慢性神經(jīng)退行性疾病〔1〕，臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強(qiáng)直和運(yùn)動(dòng)遲緩等癥狀，病理變化主要為黑質(zhì)致密區(qū)(SN)多巴胺(DA)能神經(jīng)元進(jìn)行性死亡或缺失〔2〕。目前該病的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但有研究表明，在PD中選擇性DA能神經(jīng)元損傷與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)〔3〕。1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)是一種DA能神經(jīng)元毒性劑，被廣泛應(yīng)用于PD發(fā)病機(jī)制和藥效學(xué)評(píng)價(jià)的研究〔4〕。豨薟草為常用中草藥，是一年生草本植物豨薟 、腺梗豨薟或毛梗豨薟的全草〔5〕。據(jù)報(bào)道，豨薟草有抗炎〔6，7〕、抗風(fēng)濕〔8〕、降壓〔9，10〕、抗腫瘤〔11〕等多方面的作用。婁月芬等〔12〕研究證明，豨薟草提取液能明顯保護(hù)腦缺血再灌注的大腦皮層神經(jīng)元損傷模型，其機(jī)制與豨薟草抗氧化作用有關(guān)。但是關(guān)于豨薟草提取液治療PD的物質(zhì)基礎(chǔ)和具體作用機(jī)制在國(guó)內(nèi)外還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)探討豨薟草提取液治療PD的作用和機(jī)制。

1材料和方法

1.1主要試劑豨薟草購(gòu)自河北祁新中藥顆粒有限公司，經(jīng)河北省藥品檢驗(yàn)院段吉平主任藥師鑒定為腺梗豨薟的地上部分，水煎煮提取，低溫濃縮，提取物濃度為2 mg/ml(以總黃酮計(jì))；96孔培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司；MTT、DMSO和MPP+均購(gòu)自Sigma公司；DCFH-DA購(gòu)自Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清和馬血清購(gòu)自Gibco BRL公司。

1.2主要儀器倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司產(chǎn)品；IX70)；CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)，HERAD-63450)；酶標(biāo)儀(美國(guó) Bio Rad3550)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理PC12細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，由本實(shí)驗(yàn)室傳代并保存。PC12細(xì)胞置于含5%胎牛血清，10%馬血清的DMEM培養(yǎng)液中，并在含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞每2～3天更換1次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到80%即可傳代培養(yǎng)。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞以2×105/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，24 h細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，每孔加入含不同濃度(100、250、400、550 和700 μmol/L)MPP+和(或)豨薟草提取物的培養(yǎng)液100 μl，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組：無(wú)細(xì)胞，并加入不含MPP+的培養(yǎng)液；陰性對(duì)照組：細(xì)胞正常培養(yǎng)，不給予任何處理試劑；MPP+處理組：MPP+單獨(dú)處理PC12細(xì)胞；豨薟草提取物+MPP+組：豨薟草提取物設(shè)三個(gè)濃度(2.00、4.00和8.00 μg/ml)，MPP 濃度為400 μmol/L。每組各設(shè)定6個(gè)復(fù)孔。

1.5細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察將各組細(xì)胞放置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變情況并拍照記錄。

1.6MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性在培養(yǎng)板上接種處于指數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞，每孔加細(xì)胞懸液100 μl，接種量2×105/ml，加入等體積、不同濃度的豨薟草提取物或MPP+。MPP+處理組加入含MPP+的等體積溶劑，豨薟草提取物+MPP+組加入等體積的混合溶液，并分別設(shè)6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。在結(jié)束培養(yǎng)前4 h，每孔加入MTT 溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩5 min后，酶標(biāo)儀490 nm處檢測(cè)每孔的吸光度(A)值。細(xì)胞存活率=(陰性對(duì)照組A值-空白對(duì)照組A值)/(加藥組A值-空白對(duì)照組A值)×100%。

1.7PC12細(xì)胞內(nèi)ROS水平的檢測(cè)按照試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行操作。PC12細(xì)胞內(nèi)ROS水平采用熒光探針DCFH-DA孵育后，熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。將PC12細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，分組干預(yù)，每組設(shè)定6個(gè)復(fù)孔。干預(yù)結(jié)束后，每孔加入DCFH-DA，終濃度為10 μmol/L，37℃避光孵育60 min，PBS清洗3次，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)DCF熒光強(qiáng)度，檢測(cè)結(jié)果采用HMIAS-2000型圖文分析軟件進(jìn)行分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析及q檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1MPP+對(duì)PC12細(xì)胞的影響MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，正常 PC12細(xì)胞給予不同濃度MPP+(100，250，400，550和700 μmol/L)48 h后，細(xì)胞存活率隨藥物濃度的增加而呈劑量依賴性降低〔(88±7.03)%、(77±5.46)%、(56±6.23)%、(32±6.88)%、(26±3.12)%〕。當(dāng)MPP+濃度在400 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率基本維持在60%左右。為使細(xì)胞處于損傷狀態(tài)又不致使細(xì)胞過度死亡，本實(shí)驗(yàn)選擇400 μmol/L的MPP+構(gòu)建PC12細(xì)胞損傷模型。

2.2豨薟草提取液對(duì)MPP+損傷的PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變的影響正常PC12細(xì)胞呈圓形、梭形或多邊形，為貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，可有一到多條的類似神經(jīng)突起的細(xì)胞突起出現(xiàn)，細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)12～24 h后細(xì)胞成簇生長(zhǎng)，2～3 d后突起明顯增多增長(zhǎng)，可見多數(shù)突起從細(xì)胞邊緣發(fā)出，相互連接成網(wǎng)狀，在倒置顯微鏡下呈強(qiáng)折光性，核不易見。加入MPP+損傷后，細(xì)胞先腫脹，折光度增強(qiáng)后，細(xì)胞圓縮、脫落。400 μmol/L的MPP+作用于PC12細(xì)胞后4～5 h即可見部分細(xì)胞體腫脹，細(xì)胞形態(tài)改變，折光減弱，作用24 h后，大部分PC12細(xì)胞胞體變小、變圓，失去折光性，細(xì)胞突起明顯減少、縮短，細(xì)胞之間的突起連接明顯減少。細(xì)胞可由貼壁生長(zhǎng)脫落到細(xì)胞培養(yǎng)液中懸浮，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)活細(xì)胞逐漸減少。經(jīng)過豨薟草提取液處理的PC12細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變與模型組PC12細(xì)胞比較有明顯的改善。在顯微鏡下見活細(xì)胞數(shù)明顯增加，細(xì)胞的脫落率下降，細(xì)胞的貼壁率提高，細(xì)胞折光性增加，細(xì)胞間仍可見比較多的細(xì)胞聯(lián)系，細(xì)胞仍以簇狀生長(zhǎng)為主，散在單一的細(xì)胞較少，接近正常組細(xì)胞。豨薟草提取液能明顯改善PC12細(xì)胞的損傷狀態(tài)(圖1)。

2.3豨薟草提取液對(duì)MPP+損傷的PC12細(xì)胞存活率的影響MTT結(jié)果顯示，400 μmol/L MPP+導(dǎo)致PC12細(xì)胞存活率較對(duì)照組明顯下降〔(54±4.24)%vs(100±7.11)%〕，同時(shí)給予不同濃度豨薟草提取液可增加細(xì)胞存活率，在2.00、4.00、8.00 μg/ml范圍內(nèi)具有濃度依賴性，其中4.00〔(72±6.14)%〕和8.00 μg/ml〔(81±6.71)%〕濃度組與MPP+處理組比較差異顯著，表明豨薟草提取液對(duì)MPP+誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡具有一定的抑制作用。

2.4MPP+與豨薟草提取液對(duì)PC12細(xì)胞ROS的影響MPP+與PC12細(xì)胞孵育48 h后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯高于對(duì)照組(507±27 vs 230±20，P<0.01)。加入8.00 μg/ml的豨薟草提取液干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯低于MPP+組〔(348±25)，P<0.05〕。見圖2。

A：對(duì)照組 B：MPP+處理組；C：4.00 μg/ml豨薟草提取物+MPP+ 處理組，下圖同圖1　豨薟草提取液對(duì)MPP+損傷的PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(×100)

圖2　DCFH-DA 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS(×100)

3討論

PD殘留的神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)以異常修飾和聚集的突觸核蛋白為主要成分的嗜酸性包涵體——路易體(LB)〔13〕。目前PD的發(fā)病機(jī)制仍不明確，許多學(xué)者認(rèn)為氧化應(yīng)激損害，尤其是DA通過非酶促的自氧化產(chǎn)生活性氧簇(ROS)可能是導(dǎo)致DA能神經(jīng)元選擇性損傷的重要原因〔14〕。PC12細(xì)胞為大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞，它能表達(dá)酪氨酸羥化酶并且合成多巴胺，因而也被稱為多巴胺能細(xì)胞。MPP+是1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，MPP+作用于PC12細(xì)胞建立的細(xì)胞模型已得到國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)界公認(rèn)，并被廣泛用于PD的實(shí)驗(yàn)研究〔15〕。本研究發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組比較，MPP+處理組細(xì)胞活性降低，ROS水平升高；而豨薟草提取液對(duì)細(xì)胞活性的降低和細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高具有抑制作用。因此，我們推測(cè)豨薟草提取液可能通過抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，減少神經(jīng)元的損傷，從而發(fā)揮抗PD的作用。但豨薟草對(duì)神經(jīng)元凋亡的具體作用及保護(hù)機(jī)制、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等還有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)4

1Bezard E，Przedborski S.A tale on animal models of Parkinson's disease.Movement disorders〔J〕.Off J Movement Disord Soc，2011；26(6)：993-1002.

2Fahn S.The spectrum of levodopa-induced dyskinesias〔J〕.Ann Neurol,2000;47(4 Suppl 1)：S2-9.

3Levy OA，Malagelada C，Greene LA.Cell death pathways in Parkinson's disease：proximal triggers，distal effectors，and final steps〔J〕.Apoptosis,2009；14(4)：478-500.

4Singer TP，Ramsay RR.Mechanism of the neurotoxicity of MPTP.An update〔J〕.FEBS Lett，1990；274(1-2)：1-8.

5張豐強(qiáng).臨床大本草〔M〕.北京：華夏出版社，2000：887-9.

6孫貴才，于雪峰，李登宇，等.復(fù)方豨薟草膠囊治療反復(fù)性關(guān)節(jié)炎的臨床療效觀察〔J〕.中醫(yī)藥信息，2007;24(2)：34-5.

7Park HJ，Kim IT，Won JH，etal.Anti-inflammatory activities of ent-16alphaH，17-hydroxy-kauran-19-oic acid isolated from the roots of Siegesbeckia pubescens are due to the inhibition of iNOS and COX-2 expression in RAW 264.7 macrophages via NF-kappaB inactivation〔J〕.Eur J Pharmacol,2007;558(1-3)：185-93.

8胡慧華，湯魯霞，李小猛.豨薟草生品和炮制品抗炎、抗風(fēng)濕作用的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中國(guó)中藥雜志，2004;29(6)：542-5.

9Kang BK，Lee EH，Kim HM.Inhibitory effects of Korean folk medicine 'Hi-Chum' on histamine release from mast cells in vivo and in vitro〔J〕.J Ethnopharmacol,1997;57(2)：73-9.

10Wang GJ，Shan J，Pang PK，etal.The vasorelaxing action of rutaecarpine：direct paradoxical effects on intracellular calcium concentration of vascular smooth muscle and endothelial cells〔J〕.J Pharmacol Exp Ther,1996;276(3)：1016-21.

11汪建平，羅瓊，阮金蘭，等.豨薟草對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的體外抑制效應(yīng)〔J〕.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009;28(1)：45-6.

12婁月芬，李盈，胡濱.豨薟草總黃酮對(duì)大鼠腦缺血損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制研究〔J〕.藥學(xué)實(shí)踐雜志，2013;31(1)：42-4.

13Blum D，Torch S，Lambeng N，etal.Molecular pathways involved in the neurotoxicity of 6-OHDA，dopamine and MPTP：contribution to the apoptotic theory in Parkinson’s disease〔J〕.Prog Neurobiol，2001;65(2)：135-72.

14Hashimoto M，Hsu IJ，Xia Y，etal.Oxidative stress induces amyloid-like aggregate formation of NACP/alpha-synuclein in vitro〔J〕.Neuroreport，1999;10(4)：717-21.

15Kang D，Miyako K，Kuribayashi F，etal.Changes of energy metabolism induced by 1-methyl-4-phenylpyridinium(MPP+)-related compounds in rat pheochromocytoma PC12 cells〔J〕.Arch Biochem Biophys,1997;337(1)：75-80.

〔2015-06-17修回〕

(編輯曹夢(mèng)園)

通訊作者：王彥永(1976-)，男，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事腦小血管病研究。

中圖分類號(hào)〔〕R742.5〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)24-7042-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.033