芮丹云　唐麗媛　陳　潔　鄒天南

(昆明學(xué)院醫(yī)學(xué)院，云南　昆明　650214)

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補(bǔ)腎活血顆粒對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨組織中OPG/RANKL mRNA及蛋白表達(dá)的影響

芮丹云唐麗媛陳潔1鄒天南1

(昆明學(xué)院醫(yī)學(xué)院，云南昆明650214)

摘要〔〕目的探討補(bǔ)腎活血顆粒對(duì)骨質(zhì)疏松(OP)大鼠骨組織中骨保護(hù)蛋白/核因子-β受體活化因子配體(OPG/RANKL)mRNA及蛋白表達(dá)的影響。方法采用卵巢摘除法建立SD大鼠OP模型。分別給予生理鹽水(模型組)、50 mg/kg補(bǔ)腎活血顆粒(低劑量組)、100 mg/kg補(bǔ)腎活血顆粒(中劑量組)、200 mg/kg補(bǔ)腎活血顆粒(高劑量組)、30 μg/kg 17β-雌二醇(雌激素組)干預(yù)治療12 w，設(shè)立假手術(shù)組為對(duì)照。比較各組骨密度(BMD)、骨組織中OPG/RANKL mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組大鼠BMD、OPG/RANKL mRNA及蛋白表達(dá)顯著減低(P<0.05)。與模型組比較，低、中、高劑量組及雌激素組BMD、OPG/RANKL mRNA及蛋白表達(dá)明顯提高(P<0.05)。高劑量組BMD、OPG/RANKL mRNA及蛋白表達(dá)顯著高于低、中劑量組及雌激素組(P<0.05)。結(jié)論補(bǔ)腎活血顆粒可有效改善OP大鼠骨密度，調(diào)節(jié)OPG/RANKL可能是其作用機(jī)制。

關(guān)鍵詞〔〕補(bǔ)腎活血顆粒；骨質(zhì)疏松；OPG；RANKL

1云南省第一人民醫(yī)院

第一作者：芮丹云(1981-)，男，講師，在讀碩士，主要從事分子生物學(xué)方面的研究。

老年人是骨質(zhì)疏松(OP)的高發(fā)人群，發(fā)生率逐年遞增，骨折風(fēng)險(xiǎn)大大增加〔1〕。中醫(yī)理論認(rèn)為，腎虛、血瘀是誘發(fā)OP的主要病機(jī)，故補(bǔ)腎化瘀原則應(yīng)貫穿OP治療始終〔2〕。補(bǔ)腎活血顆粒具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)，調(diào)氣活血之功效。補(bǔ)腎活血顆粒治療OP的臨床療效已得到公認(rèn)，但其作用機(jī)制尚未明確〔3〕。骨保護(hù)蛋白(OPG)/核因子-β受體活化因子配體(RANKL)信號(hào)通路是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的參與骨重建的重要途徑之一，其在OP的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔4〕。本研究旨在為OP癥的基礎(chǔ)研究及補(bǔ)腎活血顆粒的推廣應(yīng)用提供可靠依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器與試劑補(bǔ)腎活血顆粒OPG/RANKL引物(上海生工)；OPG/RANKL抗體、DNA marker DL2000(Takara公司)；PCR儀、RNA PCR Kit(ABI公司)；WB顯影劑(南京建成生物有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組選取48只雌性SPF級(jí)SD大鼠，體重310～370 g，8月齡，按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為6組，每組8只，即假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)腎活血顆粒低劑量組(簡(jiǎn)稱(chēng)低劑量組)、補(bǔ)腎活血顆粒中劑量組(簡(jiǎn)稱(chēng)中劑量組)、補(bǔ)腎活血顆粒高劑量組(簡(jiǎn)稱(chēng)高劑量組)、雌激素治療組(簡(jiǎn)稱(chēng)雌激素組)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1OP模型建立1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，假手術(shù)組：沿大鼠背側(cè)后方髂骨嵴上方約2 cm、脊柱旁約1 cm處做一縱形切口，暴露卵巢并將其輕輕提起，卵巢復(fù)位，逐層關(guān)閉腹腔。模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、雌激素組：以同樣方法暴露雙側(cè)卵巢，并行手術(shù)切除，絲線(xiàn)結(jié)扎殘端，逐層關(guān)閉腹腔。

1.3.2給藥方式各組大鼠術(shù)后均給予抗感染治療。術(shù)后正常喂養(yǎng)2 w，之后給予連續(xù)藥物干預(yù)。假手術(shù)組、模型組：每日給予2 ml生理鹽水灌胃，1次/d。低、中、高劑量組：每日分別給予2 ml補(bǔ)腎活血顆粒(50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg)灌胃，1次/d。雌激素組：每日給予17β-雌二醇(30 μg/kg)皮下注射，1次/d。連續(xù)干預(yù)12 w。

1.3.3骨密度(BMD)檢測(cè)處死大鼠，取右側(cè)完整股骨標(biāo)本，采用雙能X線(xiàn)BMD測(cè)量?jī)x測(cè)定股骨全長(zhǎng)BMD(tBMD)。

1.3.4組織病理學(xué)檢測(cè)選取股骨標(biāo)本節(jié)段，生理鹽水反復(fù)沖洗，10%中性甲醛固定48 h，10%乙二胺四乙酸二鈉(EDTANa2)脫鈣處理，分別使用以下濃度的酒精并按順序進(jìn)行脫水：30%→50%→70%→80%→90%→95%→100%(I)→100%(Ⅱ)，取出組織，放入二甲苯與無(wú)水酒精混合溶液中浸泡1 h，取出后放入純二甲苯中浸泡20 min，縱向石蠟包埋，已經(jīng)包埋好的蠟塊取出，修整后安裝于持蠟器上，切片機(jī)一次性連續(xù)切片8張，切片厚度約為4～6 μm，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，封片，鏡下觀(guān)察。

1.3.5OPG/RANKL mRNA檢測(cè)采用RT-PCR檢測(cè)骨組織中OPG/RANKL mRNA表達(dá)。操作TRIZOL試劑盒說(shuō)明書(shū)提取骨組織總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表1，以還原型輔酶Ⅱ(GAPDH)為內(nèi)參。

表1PCR引物序列

引物序列片段長(zhǎng)度OPG上游5'-TCCTGGCACCTACCTAATACAGCA-3'117bp下游5'-CTACACTCTCGGCATTCACTTTGG-3'RANKL上游5'-AGCCTTTCAAGGGGCCGTGC-3'104bp下游5'-GGGCCACATCGAGCCACGAA-3'GAPDH上游5'-TAAAGGGCATCCTGGGTACACT-3'199bp下游5'-TTACTCCTTGGAGGCCATGTAGG-3'

1.3.6OPG/RANKL蛋白檢測(cè)采用Western印跡法檢測(cè)骨組織中OPG/RANKL蛋白表達(dá)水平。常規(guī)提取骨組織總蛋白，定量測(cè)試盒測(cè)定總蛋白濃度，按4∶1比例分別加入5倍上樣緩沖液和蛋白樣品，煮沸3min，配制聚丙烯酰胺凝膠，上樣，跑膠1.5 h，0℃ 100 V轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂乳室溫封閉1.5 h，F(xiàn)OXO1抗體稀釋1 000倍后4℃孵育過(guò)夜，洗膜3次，二抗孵育2 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)試劑顯色，后用軟件進(jìn)行蛋白表達(dá)定量分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行單因素方差檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1骨組織切片結(jié)果假手術(shù)組骨小梁結(jié)構(gòu)正常，骨皮質(zhì)致密均一；模型組骨小梁結(jié)構(gòu)發(fā)生改變骨皮質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松、變??；高劑量組骨小梁略有變薄，但排列較為整齊，且可連接成網(wǎng)，其密度尚為正常。見(jiàn)圖1。

圖1　股骨組織切片

2.2BMD與假手術(shù)組〔(0.199±0.005)mg/cm3〕比較，模型組〔(0.183±0.006)ng/cm3〕大鼠股骨全長(zhǎng)BMD顯著減低(P<0.05)。與模型組比較，低、中、高劑量組及雌激素組BMD〔(0.189±0.004)mg/cm3,(0.194±0.005)mg/cm3,(0.199±0.003)mg/cm3,(0.192±0.004)mg/cm3〕明顯提高(P<0.05)。高劑量組BMD顯著高于低、中劑量組及雌激素組(P<0.05)。

2.3OPG/RANKL mRNA與假手術(shù)組相比較，模型組OPG mRNA、RANKL mRNA顯著減低(P<0.05)。與模型組相比較，低、中、高劑量組及雌激素組OPG mRNA、RANKL mRNA明顯提高(P<0.05)。高劑量組OPG mRNA、RANKL mRNA顯著高于低、中劑量組及雌激素組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

組別OPGRANKL假手術(shù)組0.725±0.0111)0.978±0.0311)模型組0.412±0.0120.485±0.022低劑量組0.548±0.0181)2)0.592±0.0151)2)中劑量組0.604±0.0251)2)0.604±0.0281)2)高劑量組0.683±0.0131)0.717±0.0421)雌激素組0.662±0.0141)2)0.594±0.0351)2)

與模型組比較：1)P<0.05；與高劑量組比較：2)P<0.05；下表同

2.4OPG/RANKL蛋白表達(dá)與假手術(shù)組比較，模型組OPG、RANKL蛋白表達(dá)顯著減低(P<0.05)。與模型組比較，低、中、高劑量組及雌激素組OPG、RANKL蛋白表達(dá)明顯提高(P<0.05)。高劑量組OPG、RANKL蛋白表達(dá)顯著高于低、中劑量組及雌激素組(P<0.05)。見(jiàn)表3，圖2。

組別OPGRANKL假手術(shù)組0.613±0.0531)0.923±0.0311)模型組0.137±0.0110.385±0.022低劑量組0.287±0.0421)2)0.492±0.0151)2)中劑量組0.464±0.0361)2)0.604±0.0281)2)高劑量組0.589±0.0331)0.717±0.0421)雌激素組0.492±0.0511)2)0.584±0.0351)2)

1：假手術(shù)組；2：模型組；3：低劑量組；4：中劑量組；5：高劑量組；6：雌激素組圖2　各組OPG/RANKL 蛋白表達(dá)水平比較

3討論

正常生理狀態(tài)下，人體內(nèi)成骨細(xì)胞(OB)骨質(zhì)沉積于破骨細(xì)胞(OC)骨質(zhì)吸收處于動(dòng)態(tài)平衡。病理狀態(tài)下，骨重建率大大提高，由于骨形成周期明顯長(zhǎng)于骨吸收周期，故新骨形成速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于舊骨吸收速度，從而導(dǎo)致骨丟失，進(jìn)而引發(fā)包括OP在內(nèi)的多種骨代謝疾病。因此，調(diào)控骨重建、抑制骨吸收已成為防治OP的重要策略。近年來(lái)研究證實(shí)，OPG/RANKL系統(tǒng)與骨重建過(guò)程密切相關(guān)〔5〕。OPG屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族成員，主要由OB細(xì)胞分泌，并以二聚體形式存在〔6〕。RANKL屬于TNF配體超家族成員，具有促進(jìn)OC分化，阻值OC凋亡等作用〔7〕。OPG可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地與三聚體RANKL相結(jié)合，阻斷RANKL與核因子-κβ受體活化因子(RANK)結(jié)合，從而抑制OC前體活化及成熟OC活化，降低骨吸收活性，誘導(dǎo)OC凋亡〔8〕。骨組織中OPG/RANKL比例變化可直接影響OC生成、BMD及骨強(qiáng)度，并最終誘發(fā)OP〔9〕。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為OP屬于“骨痹”、“骨萎”范疇，氣血阻滯、腎精虧虛是其主要病機(jī)，故用藥應(yīng)以補(bǔ)腎活血方劑為主〔10〕。補(bǔ)腎活血方是中醫(yī)臨床治療OP的經(jīng)典方劑〔11〕。全方由熟地、肉桂、杜仲、山藥、附子、枸杞、甘草、紅花、山茱萸組成。既往基礎(chǔ)研究證實(shí)，補(bǔ)腎活血顆?？娠@著提高去勢(shì)大鼠血清雌激素水平，促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收，增加BMD，提高骨組織力學(xué)性能，從而達(dá)到預(yù)防去勢(shì)大鼠OP的作用〔12〕。但補(bǔ)腎活血顆粒治療OP的作用機(jī)制尚未完全明確。本研究結(jié)果證實(shí)OPG/RANKL系統(tǒng)在維持股骨頭BMD中發(fā)揮重要作用。采用補(bǔ)腎活血顆粒與雌激素進(jìn)行干預(yù)治療，均可有效上調(diào)骨組織中OPG/RANKL mRNA及蛋白表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，切除大鼠雙側(cè)卵巢后，大鼠BMD明顯降低，提示采用卵巢摘除法可成功建立OP模型。而采用補(bǔ)腎活血顆粒進(jìn)行干預(yù)治療，可有效拮抗去勢(shì)所致的BMD降低現(xiàn)象，且其拮抗作用呈明顯劑量依賴(lài)性，100 mg/kg補(bǔ)腎活血顆粒干預(yù)治療即可獲得與雌激素相當(dāng)?shù)母深A(yù)效果，200 mg/kg補(bǔ)腎活血顆粒干預(yù)治療效果優(yōu)于雌激素治療，分析其原因可能與補(bǔ)腎活血顆粒可明顯促進(jìn)骨組織中OPG/RANKL mRNA及蛋白表達(dá)有關(guān)，OPG/RANKL表達(dá)上調(diào)有利于抑制破骨性骨吸收，增加BMD，從而發(fā)揮防治OP的效果。

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〔2015-03-17修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者：鄒天南(1967-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事脊柱外科、骨質(zhì)疏松方面的研究。

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R68〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)24-7036-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.030