李運(yùn)華　鄔遠(yuǎn)林　黃紅芬　丁衛(wèi)江

(萍鄉(xiāng)市衛(wèi)生學(xué)校，江西　萍鄉(xiāng)　337000)

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苦參堿對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)認(rèn)知功能障礙小鼠空間記憶和海馬神經(jīng)再生能力的影響

李運(yùn)華鄔遠(yuǎn)林黃紅芬丁衛(wèi)江1

(萍鄉(xiāng)市衛(wèi)生學(xué)校，江西萍鄉(xiāng)337000)

摘要〔〕目的探索苦參堿(Mat)對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)認(rèn)知功能障礙小鼠空間記憶和海馬神經(jīng)再生能力的影響。方法采用向雄性ICR小鼠(25～30 g)側(cè)腦室立體定向注射Aβ25～35誘導(dǎo)認(rèn)知功能障礙模型，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為模型組、Mat低、中、高劑量組(每組20只)，選取同齡未處理的正常小鼠20只作對(duì)照(對(duì)照組)。Mat低、中、高劑量組分別于術(shù)后7 d每天灌胃30、60、100 mg/kg Mat，而模型組和對(duì)照組僅給予等體積生理鹽水。治療4 w后采用Morris水迷宮檢測(cè)各組空間記憶水平(登臺(tái)潛伏期、站臺(tái)所在象限停留比例及游泳速度)；取各組小鼠的海馬組織制備病理切片，分別采用溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)染色和Hoechst 33258染色檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞的增殖和凋亡情況；制備海馬組織勻漿液，檢測(cè)各組的生長相關(guān)蛋白(GAP)-43水平(Western印跡法)和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)(試劑盒檢測(cè))。結(jié)果與對(duì)照組比較，模型組訓(xùn)練3 d后的登臺(tái)潛伏期延長，而Mat各處理組訓(xùn)練3 d后的登臺(tái)潛伏期均短于模型組(P<0.05)；模型組的站臺(tái)所在象限停留比例低于對(duì)照組(P<0.05)；Mat低、中、高劑量組的站臺(tái)所在象限停留比例均高于模型組(P<0.05)；Mat可呈劑量依賴的方式縮短登臺(tái)潛伏期及延長站臺(tái)所在象限停留比例。與對(duì)照組相比，模型組的海馬BrdU陽性細(xì)胞數(shù)、GAP-43蛋白含量及超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性降低，Hoechst陽性細(xì)胞數(shù)和丙二醛(MDA)含量升高，且 Mat處理后可改善以上指標(biāo)異常，且改善效應(yīng)呈劑量依賴方式(P<0.05)。結(jié)論Mat可改善Aβ25～35誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙小鼠空間記憶和海馬神經(jīng)再生能力，對(duì)海馬神經(jīng)有保護(hù)效果，可能與其減輕氧化應(yīng)激有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕認(rèn)知功能障礙；苦參堿；空間記憶；海馬神經(jīng)再生

1南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

第一作者：李運(yùn)華(1965-)，男，高級(jí)講師，主要從事神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究。

阿爾茨海默病(AD)是老年癡呆的最常見病因，主要特征為漸進(jìn)的神經(jīng)退行性改變和腦內(nèi)β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積〔1〕。AD的神經(jīng)退行性病變與神經(jīng)元減少及神經(jīng)病變有關(guān)〔2〕。AD發(fā)生發(fā)展過程中伴有增強(qiáng)的氧化應(yīng)激和過剩的自由基水平，且活性氧等自由基產(chǎn)生是介導(dǎo)AD發(fā)生發(fā)展中神經(jīng)元死亡的主要因子〔3〕，提示改善氧化應(yīng)激為改善AD學(xué)習(xí)記憶功能的可行策略?？鄥A(Mat)具有較好的抗氧化作用〔4，5〕及神經(jīng)保護(hù)作用〔6〕。本研究給予Aβ25～35誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙小鼠Mat，觀察對(duì)空間記憶和海馬神經(jīng)再生能力的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組采用向雄性25～30 g ICR小鼠(北京維通利華公司)側(cè)腦室立體定向注射Aβ25～35來誘導(dǎo)認(rèn)知功能障礙模型，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為模型組、Mat低、中、高劑量組(每組20只)，選取同齡未處理的正常小鼠20只作對(duì)照(對(duì)照組)。Mat低、中、高劑量組分別于術(shù)后7 d每天灌胃30、60、100 mg/kg Mat治療，而模型組和對(duì)照組僅給予等體積生理鹽水。所有小鼠均飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境，飼養(yǎng)室保持20°C、60%～70%濕度，12 h/12 h明暗周期飼養(yǎng)，可自由獲取食、水。

1.2主要試劑與儀器Aβ25～35、溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)和Hoechst 33258購自Sigma公司，Mat購自陜西省科學(xué)院西安植物園植物化學(xué)開發(fā)研究所(純度為99.5%)，生長相關(guān)蛋白(GAP)-43多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定試劑盒均購自南京建成生物工程研究院，丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。51600型立體定位儀購自美國Stoelting 公司，Morris水迷宮購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，美國ELx800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀購自Bio-TEK公司。

1.3動(dòng)物模型制備將Aβ25～35溶于無菌生理鹽水(2 μg/μl)，使用前于37℃孵育1 w，4℃保存?zhèn)溆?。大鼠稱重后采用腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)進(jìn)行麻醉，將小鼠頭部固定于立體定位儀，依次剪開小鼠頭部皮膚、暴露顱骨和前囟，參照小鼠腦圖譜，以前囟為零點(diǎn)，坐標(biāo)為前囟后0.8 mm，右側(cè)旁開1.4 mm，顱骨表面下3.7 mm，于顱骨上用牙鉆打孔，微量進(jìn)樣器垂直進(jìn)入右側(cè)腦室后注入10 μl凝聚態(tài)Aβ25～35(注射時(shí)間為5 min)。對(duì)照組注射同體積的生理鹽水，其余步驟一致。完成手術(shù)后，縫合皮膚并完成青霉素肌肉注射。

1.4空間記憶功能檢測(cè)采用Morris水迷宮檢測(cè)空間記憶功能，水迷宮為圓形水池(直徑130 cm，高50 cm)，水溫19℃～20℃，根據(jù)池壁上標(biāo)的東南西北4個(gè)點(diǎn)將圓形水池分為右下、右上、左上、左下共4個(gè)象限，于右下象限正中設(shè)有平臺(tái)，水面高于平臺(tái)1.5 cm。均于治療4 w后開始訓(xùn)練，歷時(shí)6 d，訓(xùn)練時(shí)按右下、右上、左上、左下四個(gè)象限依次將小鼠面向池壁放入水中(訓(xùn)練時(shí)間為60 s)，記錄潛伏期和游泳速度等指標(biāo)。將平臺(tái)撤去，記錄60 s內(nèi)大鼠為搜索平臺(tái)而穿過原平臺(tái)放置區(qū)域的時(shí)間與總游泳時(shí)間的比例。

1.5海馬區(qū)新生細(xì)胞檢測(cè)BrdU染色用于標(biāo)記新生細(xì)胞。Aβ25～35注射24 h后，每天連續(xù)3次腹腔注射BrdU(50 mg/kg)，4 w后采用4%多聚甲醛灌注固定，取出腦組織并制備海馬部位冠狀連續(xù)切片(厚約40 μm)，每5張腦片保留1張，常規(guī)處理后一抗4℃孵育24 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗片后，加入生物素標(biāo)記的二抗(稀釋比例1∶100)室溫孵育30 min，DAB顯色，將切片貼于載玻片上，用中性樹膠封片。在200倍物鏡下，計(jì)數(shù)海馬區(qū)的BrdU陽性細(xì)胞數(shù)。

1.6海馬區(qū)凋亡細(xì)胞檢測(cè)取腦組織，制備厚約4 μm的海馬部位冠狀連續(xù)石蠟切片，脫蠟水化后加入0.5 ml 的Hoechst 33258染色液，5 min后滴加抗淬滅封片液，在350 nm激發(fā)波長下，采用熒光顯微鏡(40倍物鏡)計(jì)數(shù)Hoechst陽性細(xì)胞數(shù)。

1.7海馬組織GAP-43水平檢測(cè)采用Western印跡法檢測(cè)海馬組織GAP-43的蛋白水平。快速收集海馬組織后加入組織裂解液，研磨充分后制備勻漿，12 000 r/min離心20 min后，取上清采用lowry法測(cè)定蛋白濃度。每個(gè)樣本取等量蛋白(20 μg)，行常規(guī)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，半干法轉(zhuǎn)膜后根據(jù)膜面積加入適量的GAP-43一抗(1∶200)，4℃孵育過夜加入二抗(1∶3 000)室溫下?lián)u蕩孵育2 h。采用化學(xué)發(fā)光ECL顯色后采用Gel-Pro analyzer軟件分析各目的條帶光密度，GAP-43相對(duì)表達(dá)量為其光密度與GAPDH的比值。

1.8氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)過量麻醉法處死小鼠后迅速取腦，置于液氮中至適當(dāng)硬度，收集海馬組織，于冰上研磨并裂解15 min；12 000 r/min離心20 min，收集上清并根據(jù)試劑盒說明書檢測(cè)MDA含量及SOD和CAT活性。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD法檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1Mat處理對(duì)各組空間記憶水平的影響

2.1.1登臺(tái)潛伏期各組訓(xùn)練1～2 d登臺(tái)潛伏期無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對(duì)照組比較，模型組訓(xùn)練3 d后的登臺(tái)潛伏期延長，而Mat各處理組訓(xùn)練3 d后的登臺(tái)潛伏期均短于模型組(P<0.05)；Mat高劑量組訓(xùn)練4～6 d后的登臺(tái)潛伏期均短于Mat低劑量組和Mat中劑量組(P<0.05)。見表1。

組別1d2d3d4d5d6d對(duì)照組70.14±3.1254.23±2.7537.22±4.0524.82±1.8518.65±1.7217.37±2.06模型組72.37±4.2857.46±3.5253.96±2.641)42.31±3.231)38.79±2.281)35.25±2.241)Mat低劑量組69.25±3.4360.08±4.2647.23±3.461)2)37.28±2.291)2)34.26±1.661)2)30.63±1.721)2)Mat中劑量組71.48±2.2959.77±3.9843.17±3.111)2)3)35.63±3.431)2)31.28±2.421)2)3)27.58±1.951)2)3)Mat高劑量組68.63±1.6562.34±3.3442.61±2.421)2)3)30.24±2.621)2)3)4)26.35±2.811)2)3)4)22.19±2.181)2)3)4)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與Mat低劑量組比較：3)P<0.05；與Mat中劑量組比較：4)P<0.05;下表同

2.1.2站臺(tái)所在象限停留時(shí)間比例模型組的站臺(tái)所在象限停留比例為(19.46±2.71)%，低于對(duì)照組的(34.55±4.37)%(P<0.05)；Mat低、中、高劑量組的站臺(tái)所在象限停留比例依次為(23.24±3.20)%、(27.13±2.74)%和(32.09±3.69)%，均高于模型組(P<0.05)；且除Mat高劑量組外，其余Mat處理組仍低于對(duì)照組(P<0.05)；隨著Mat劑量的升高，站臺(tái)所在象限停留比例升高，改善效應(yīng)呈劑量依賴的方式。

2.1.3游泳時(shí)間對(duì)照組、模型組、Mat低、中、Mat高劑量組的游泳速度依次為(11.82±3.06)、(12.37±3.47)、(12.71±3.80)、(11.72±1.46)、(12.53±3.32)cm/s，各組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.2Mat處理對(duì)各組海馬神經(jīng)細(xì)胞增殖的影響模型組的BrdU陽性細(xì)胞數(shù)為(13.31±1.74)個(gè)/mm2，低于對(duì)照組的(33.84±2.92)個(gè)/mm2(P<0.05)；Mat低、中、高劑量組的BrdU陽性細(xì)胞數(shù)依次為(18.55±0.93)、(24.93±1.26)和(32.62±2.07)個(gè)/mm2，均高于模型組，且呈劑量依賴的方式升高(P<0.05)。見圖1。

2.3Mat處理對(duì)各組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響模型組的Hoechst陽性細(xì)胞為(12.33±2.69)個(gè)/mm2，高于對(duì)照組的(5.46±0.78)個(gè)/mm2(P<0.05)；Mat低、中、高劑量組的Hoechst陽性細(xì)胞數(shù)依次為(9.32±1.38)、(8.90±1.24)和(6.73±0.92)個(gè)/mm2，均高于模型組，且呈劑量依賴的方式降低(P<0.05)。見圖2。

2.4Mat處理對(duì)各組海馬GAP-43水平的影響模型組GAP-43的蛋白相對(duì)表達(dá)量為(0.29±0.03)，低于對(duì)照組的(0.76±0.06)(P<0.05)；Mat低、中、高劑量組的GAP-43的蛋白相對(duì)表達(dá)量依次為(0.46±0.04)、(0.53±0.05)和(0.62±0.03)，均高于模型組，呈劑量依賴的方式升高(P<0.05)。見圖3。

圖1　各組海馬區(qū)域的BrdU染色圖(×200)

圖2　各組海馬區(qū)域的Hoechst染色圖(×200)

A：對(duì)照組；B：模型組；C：Mat低劑量組；D：Mat中劑量組；E：Mat高劑量組圖3　各組海馬區(qū)域GAP-43的Western印跡原始圖

2.5Mat處理對(duì)各組海馬氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響模型組的MDA水平高于對(duì)照組，但SOD和CAT活性均低于對(duì)照組(P<0.05)；Mat低、中、高劑量組的以上指標(biāo)均優(yōu)于模型組，改善效應(yīng)均其呈劑量依賴性(P<0.05)。見表2。

組別MDA(nmol/ml)SOD(U/ml)CAT(U/ml)對(duì)照組0.42±0.1210.32±1.268.74±0.99模型組1.34±0.251)3.27±0.721)2.13±0.851)Mat低劑量組1.19±0.231)2)5.34±0.661)2)4.62±0.741)2)Mat中劑量組0.82±0.171)2)3)6.69±1.231)2)3)5.32±0.591)2)3)Mat高劑量組0.68±0.191)2)3)4)8.47±1.281)2)3)4)6.45±1.321)2)3)4)

3討論

在AD早期即可發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，如在AD患者腦部可檢測(cè)到蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物和核酸的氧化產(chǎn)物〔7，8〕。腦比其他器官消耗更多的氧，且腦部對(duì)活性氧自由基的耐受較差〔9〕，故積極控制腦部氧化應(yīng)激水平對(duì)腦部神經(jīng)保護(hù)有重要意義。Mat是從豆根槐屬植物苦參中分離出來的生物堿，已被證實(shí)具有顯著的抗氧化作用，唐美岸等〔4〕發(fā)現(xiàn)Mat可改善肺纖維化大鼠肺線粒體的氧化應(yīng)激，周茹等〔5〕發(fā)現(xiàn)Mat可通過抑制氧化應(yīng)激發(fā)揮對(duì)實(shí)驗(yàn)性銀屑病小鼠的保護(hù)作用。此外，包桂蘭等〔10〕發(fā)現(xiàn)Mat的衍生物對(duì)局灶性腦缺血大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)有較強(qiáng)的干預(yù)作用。以上證據(jù)表明Mat的抗氧化應(yīng)激作用顯著。

學(xué)習(xí)和記憶為腦的高級(jí)整合功能，作為認(rèn)識(shí)和記憶的基礎(chǔ)，其與空間學(xué)習(xí)能力減退、衰老密切相關(guān)〔11〕。本研究結(jié)果提示認(rèn)知功能障礙小鼠的模型制備成功，其空間記憶能力受損，Mat可以顯著改善Aβ毒性導(dǎo)致的空間記憶障礙，且Aβ處理對(duì)小鼠的運(yùn)動(dòng)功能無影響，同時(shí)也排除運(yùn)動(dòng)功能差異對(duì)水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，使本研究設(shè)計(jì)及結(jié)果更加科學(xué)有效。

學(xué)習(xí)和記憶的神經(jīng)基礎(chǔ)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性，突觸連接是神經(jīng)可塑性的關(guān)鍵部位，也是神經(jīng)元之間信息傳遞的重要環(huán)節(jié)〔12，13〕。海馬神經(jīng)元減少是AD發(fā)生發(fā)展中的主要病理改變，當(dāng)受損神經(jīng)細(xì)胞未被新生神經(jīng)細(xì)胞替代時(shí)，即可影響空間記憶障礙〔14〕。海馬神經(jīng)元數(shù)目在維持學(xué)習(xí)和記憶功能穩(wěn)定上發(fā)揮重要作用，提示海馬神經(jīng)元的再生情況是評(píng)價(jià)治療效果的有利指標(biāo)。高濃度Aβ25～35短肽段具有神經(jīng)毒性作用，可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞有凋亡，而Mat處理后Hoechst陽性反應(yīng)細(xì)胞減少，表明Mat可抑制Aβ25～35導(dǎo)致的新生神經(jīng)元的凋亡。

GAP-43已廣泛用于評(píng)價(jià)神經(jīng)元生長發(fā)育和神經(jīng)可塑性〔15〕。本研究進(jìn)一步表明Mat對(duì)海馬部位神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用，可逆轉(zhuǎn)Aβ25～35誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。降低氧化水平可能是Mat發(fā)揮改善認(rèn)知功能障礙小鼠空間記憶和海馬神經(jīng)再生能力的基礎(chǔ)。

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〔2015-03-27修回〕

(編輯滕欣航)

中圖分類號(hào)〔〕R749〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)24-7030-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.028