張　妍　郭榮年　孫柳青　靳俊峰　吳秀香

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，廣東　珠?！?19090)

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葡萄籽原花青素對腎血管性高血壓大鼠動態(tài)血壓、白細(xì)胞介素-18和白細(xì)胞介素-10水平的影響

張妍郭榮年孫柳青靳俊峰吳秀香

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，廣東珠海519090)

摘要〔〕目的探討葡萄籽原花青素(GSP)對腎血管性高血壓(RH)大鼠動態(tài)血壓、血清白細(xì)胞介素(IL)-18和IL-10水平和腹主動脈、腎皮質(zhì)和海馬組織中IL-10蛋白表達(dá)的影響。方法采用兩腎一夾(2K1C)法，建立RH大鼠模型，并設(shè)立假手術(shù)組(n=7)。術(shù)后2 w，選取鼠尾動脈收縮壓(SBP)超過130 mmHg的大鼠28只為RH大鼠，并隨機(jī)分為4組(n=7)：模型組；低劑量GSP組(50 mg·kg-1·d-1)；高劑量GSP組(200 mg·kg-1·d-1)及卡托普利組(30 mg·kg-1·d-1)。觀察各組大鼠尾動脈SBP的動態(tài)變化，治療6 w后，采用ELISA法檢測各組大鼠血清中IL-18和IL-10含量，Western印跡法檢測各組大鼠腹主動脈、腎皮質(zhì)及海馬組織中IL-10蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與模型組相比，用GSP治療2 w即可使RH大鼠尾動脈SBP降低(P<0.05，P<0.01)，用藥6 w后降壓效果更明顯(P<0.05，P<0.01)。同時亦能顯著增高RH大鼠血清IL-10含量和腹主動脈、腎皮質(zhì)及海馬組織IL-10蛋白表達(dá)水平，降低RH大鼠血清IL-18含量，其中以高劑量GSP組作用尤為明顯(P<0.01)，與卡托普利組的作用相當(dāng)(P>0.05)。結(jié)論GSP可以部分通過增加RH大鼠體內(nèi)抗炎因子IL-10的生成，減少促炎因子IL-18的產(chǎn)生而發(fā)揮抗炎和降壓作用。

關(guān)鍵詞〔〕葡萄籽原花青素；腎血管性高血壓；白細(xì)胞介素-18；白細(xì)胞介素-10

第一作者：張妍(1986-)，女，碩士，主要從事高血壓新藥開發(fā)研究。

高血壓是一種慢性低級別炎癥性疾病〔1,2〕，從高血壓的發(fā)生至靶器官受到損害，均與炎癥，特別是促炎因子如C-反應(yīng)蛋白，腫瘤壞死因子(TNF)-α等的產(chǎn)生增多〔3～5〕、抗炎因子如白細(xì)胞介素(IL)-10的產(chǎn)生減少有關(guān)〔6〕。是否可以通過抗感染治療輔助降壓，減輕高血壓對心腦血管等器官的損傷成為臨床研究熱點。研究表明，葡萄籽原花青素(GSP)，一種從葡萄籽中提取的多酚化合物，具有抗炎、保護(hù)心血管等多種藥理作用〔7,8〕。本研究觀察GSP對大鼠腎血管性高血壓(RH)的抗炎和降壓作用。

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器GSP由天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司惠贈，其純度≥95%，批號：1010014-27，大鼠試驗50 mg/kg、200 mg/kg；卡托普利為中美上海施貴寶制藥有限公司產(chǎn)品，批號：1007031，大鼠試驗30 mg/kg。SPF級雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量180～200 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK(粵)2008-0002；合格證號：0073204。IL-18和IL-10 ELISA試劑盒為美國R&D systems有限公司產(chǎn)品，兔抗鼠IL-10抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)為美國MBI公司產(chǎn)品，BCA蛋白定量試劑盒為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。蛋白電泳儀(美國Bio-Rad公司)；大鼠尾動脈收縮壓(SBP)測定裝置和RM6420型多道生理信號采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)。

1.2RH大鼠模型復(fù)制及RH大鼠篩選50只SD大鼠測量基礎(chǔ)尾動脈SBP后，隨機(jī)分出7只為假手術(shù)組，剩余43只為手術(shù)組，按照先前方法復(fù)制RH大鼠模型〔7〕。術(shù)后2 w選取鼠尾動脈SBP(每周測量，連續(xù)測量3次，取其平均值)≥130 mmHg的大鼠28只，為復(fù)制成功的RH大鼠，進(jìn)入本研究。

1.3動物分組及給藥復(fù)制成功的28只RH大鼠，隨機(jī)分為4組：模型組，低劑量GSP組，高劑量GSP組及卡托普利組，每組7只。治療各組大鼠每天灌胃給藥1次，給藥劑量分別為GSP 50、200 mg/kg；卡托普利30 mg/kg；假手術(shù)組和模型組，則每天灌胃以相同體積的蒸餾水，連續(xù)灌胃治療6 w。

1.4大鼠尾動脈SBP的測定采用無創(chuàng)鼠尾動脈測壓裝置及多道生理信號采集處理系統(tǒng)，分別于用藥后2 w、4 w和6 w測定各組大鼠的尾動脈SBP，每次測量3次，取其平均值。測壓時保持大鼠尾部的溫度適宜(采用間斷加溫，以大鼠保持安靜狀態(tài)和尾動脈有搏動信號為佳)。

1.5大鼠血清IL-18和IL-10含量測定灌胃6 w后，乙醚麻醉大鼠，摘眼球取血，室溫下靜置4 h，吸取血清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書加樣操作。

1.6總蛋白的提取和Western印跡法檢測IL-10蛋白表達(dá)取大鼠腹主動脈、腎皮質(zhì)及海馬組織，按照質(zhì)量體積比1∶9加入勻漿液(其中含有組織蛋白抽提液及多種蛋白酶抑制劑)分別進(jìn)行勻漿，制備成10%組織勻漿液，分別加入等體積的2倍上樣緩沖液，煮沸10 min使蛋白變性，低溫離心(4℃ 12 000 r/min)5 min后，分別取上清液，BCA法測定各組樣本的蛋白濃度，用上樣緩沖液調(diào)整蛋白的濃度，使各泳道的蛋白上樣體積為10 μl，且使其中含蛋白濃度為20 μg。進(jìn)行聚丙烯胺凝膠電泳，隨后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜(NC膜)上，經(jīng)脫脂奶粉封閉、洗脫后加IL-10抗體(1∶300)，4℃孵育過夜，再分別加入相應(yīng)Ⅱ抗(1∶2 500)，搖床孵育80 min。洗脫后，加ECL發(fā)光顯示劑，暗盒壓片、曝光，顯影、定影于膠片上。膠片經(jīng)照相后，用Bio-Rad提供的Quantity One 軟件進(jìn)行灰度值分析，以實驗各組大鼠蛋白條帶平均灰度值與同一樣品中內(nèi)參蛋白條帶的平均灰度值比值作為IL-10蛋白的相對含量。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0軟件行方差分析及LSD-t檢驗。

2結(jié)果

2.1GSP對RH大鼠尾動脈SBP的影響在GSP治療過程中，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠尾動脈SBP一直明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，GSP組從用藥2 w開始即可使高血壓大鼠尾動脈SBP降低，用藥后6 w且高劑量GSP組降壓效果更明顯(P<0.01)，與卡托普利的降壓效果相當(dāng)，與假手術(shù)組無差異(P>0.05)。見表1。

2.2GSP對RH大鼠血清IL-18、IL-10含量影響灌胃6 w后，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清IL-18含量顯著升高(P<0.01)，而IL-10含量明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，高劑量GSP組大鼠血清IL-18含量明顯降低(P<0.01)，而IL-10含量明顯升高(P<0.01)；低劑量GSP組IL-18或IL-10含量也有降低或升高，但無顯著差異(P>0.05)。見表2。

2.3GSP對RH大鼠腹主動脈、腎皮質(zhì)及海馬組織中IL-10蛋白表達(dá)的影響表3，圖1可見，經(jīng)灌胃治療6 w后，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腹主動脈、腎皮質(zhì)及海馬組織中IL-10蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，低及高劑量GSP組大鼠上述組織中IL-10蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，其中，以高劑量GSP組的降低作用尤為顯著(P<0.01)，與卡托普利組作用相當(dāng)，與假手術(shù)組相比無差異(P>0.05)。

組別用藥前用藥后2w用藥后4w用藥后6w假手術(shù)組95.08±2.8793.44±1.5394.54±1.8395.55±3.43模型組158.07±5.341)155.16±4.141)158.84±4.391)154.49±6.441)低劑量GSP組156.16±3.06150.21±2.552)142.21±5.612)136.08±4.622)高劑量GSP組159.59±2.96142.61±5.223)124.11±1.743)106.86±2.203)卡托普利組155.49±5.61141.15±3.993)122.53±2.633)105.40±2.863)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01，下表同

組別IL-18IL-10假手術(shù)組12.855±3.29615.692±3.573高血壓模型組28.384±5.7391)6.764±2.2441)低劑量GSP組25.711±5.0889.452±2.966高劑量GSP組19.152±3.5443)12.785±3.6733)卡托普利組19.425±2.0523)11.839±4.7743)

A：腹主動脈；B：腎皮質(zhì)；C：海馬；D：內(nèi)參；1：假手術(shù)組；2：模型組；3：低劑量GSP組；4：高劑量GSP組；5：卡托普利組圖1　Western印跡檢測各組大鼠不同組織中IL-10蛋白水平

組別腹主動脈腎皮質(zhì)海馬假手術(shù)組0.354±0.01470.101±0.00420.295±0.0123模型組0.185±0.01531)0.054±0.00451)0.142±0.00511)低劑量GSP組0.212±0.01723)0.061±0.00502)0.170±0.01382)高劑量GSP組0.327±0.01073)0.105±0.00303)0.242±0.00803)卡托普利組0.321±0.01433)0.094±0.00423)0.229±0.01023)

3討論

本實驗結(jié)果顯示，RH大鼠模型復(fù)制成功。同時其血清IL-18含量亦顯著升高，IL-10含量明顯降低，證實RH時，體內(nèi)有炎癥反應(yīng)的參與，與李麗娟等〔6〕的研究結(jié)果一致。IL-18是由活化的單核-巨噬等炎癥細(xì)胞產(chǎn)生的一個重要的促炎因子，其與高血壓等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切〔9,10〕。血清中促炎介質(zhì)IL-18的增多，可以通過誘生IFN-γ，激活免疫細(xì)胞，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MHC-Ⅱ類抗原的細(xì)胞因子，使血管內(nèi)皮產(chǎn)生舒血管物質(zhì)減少，縮血管物質(zhì)增多，最終使血管收縮，血壓升高。同時，IL-18能促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增生，使血管壁增厚，管腔狹窄從而升高血壓〔11〕。IL-10是主要由單核和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一種抗炎因子，可以通過抑制TNF-α等炎癥因子產(chǎn)生〔12〕、減弱NADPH氧化酶的活性使阻力血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)增強(qiáng)〔13〕，發(fā)揮保護(hù)血管內(nèi)皮的作用。RH時，大鼠血清中IL-10含量降低，致上述作用減弱，從而促進(jìn)高血壓的發(fā)生。本文結(jié)果表明，GSP降壓的機(jī)制可能與其具有減少RH大鼠血清中促炎介質(zhì)IL-18生成，增加抗炎因子IL-10的產(chǎn)生的作用有關(guān)。最近研究表明，炎癥反應(yīng)不僅參與了高血壓的發(fā)生，而且與高血壓靶器官的損害關(guān)系密切，會使心血管、腎臟及腦等多組織發(fā)生慢性炎癥反應(yīng)〔14〕。本實驗結(jié)果表明GSP可以通過增加抗炎介質(zhì)IL-10的生成，減輕炎癥反應(yīng)，發(fā)揮保護(hù)高血壓靶器官損害的作用。2010年有研究發(fā)現(xiàn)，給予外源性抗炎因子IL-10，可使懷孕誘發(fā)的高血壓大鼠的血壓和內(nèi)皮功能恢復(fù)正?！?5〕，提示，在高血壓的治療中，增強(qiáng)抗炎因子的作用不容忽視。本研究結(jié)果為高血壓的抗炎治療提供了一個新的候選者。

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〔2014-03-11修回〕

(編輯曹夢園)

通訊作者：吳秀香(1964-)，女，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事高血壓的發(fā)病機(jī)制及其防治研究。

基金項目：貴州省科技廳資助項目(黔科合J字〔2008〕2317)；貴州省高層次人才科研條件特助經(jīng)費(fèi)資助項目(TZJF-2008年58號)

中圖分類號〔〕R544.14；R282.71〔

文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)24-7018-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.023