王莉萍　王俊萍

(西安交通大學(xué)附屬紅會(huì)醫(yī)院心內(nèi)科，陜西　西安　710068)

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Dickkopf-1對(duì)SD大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及表型轉(zhuǎn)化的影響

王莉萍王俊萍1

(西安交通大學(xué)附屬紅會(huì)醫(yī)院心內(nèi)科，陜西西安710068)

摘要〔〕目的觀察Dickkopf(DKK)-1對(duì)SD大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖、遷移及表型轉(zhuǎn)化的影響。方法取大鼠主動(dòng)脈貼塊培養(yǎng)VSMC，不同濃度外源DKK-1分別作用于VSMC，然后采用cck8和transwell試驗(yàn)分別檢測(cè)DKK-1對(duì)大鼠VSMC增殖及遷移的影響。RT-PCR和Western印跡分別用于檢測(cè)VSMC去分化表型標(biāo)志基因骨橋蛋白(OPN) mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果外源性DKK-1干預(yù)后，隨著作用時(shí)間延長，DKK-1濃度增大，細(xì)胞增殖率降低，遷移能力減低；還可使VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，而在這個(gè)過程中OPN mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低。結(jié)論外源DKK-1能抑制大鼠VSMC增殖、遷移能力，并具有劑量和時(shí)間依賴性，此外，還可使VSMC從合成型向收縮型轉(zhuǎn)化。

關(guān)鍵詞〔〕Dickkopf-1；血管平滑肌細(xì)胞；骨橋蛋白；動(dòng)脈粥樣硬化

1陜西省友誼醫(yī)院心內(nèi)科

第一作者：王莉萍(1969-)，女，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事心血管疾病介入治療研究。

Wnt信號(hào)通路參與不同的發(fā)育和生理過程，在心臟發(fā)育、血管生成等過程中發(fā)揮著極為重要的作用。越來越多的證據(jù)表明Wnt信號(hào)通路參與了動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的多個(gè)進(jìn)程。最新研究表明其也參與了AS的病理生理過程，對(duì)血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的調(diào)節(jié)至關(guān)重要〔1〕。Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能障礙和VSMC增殖和遷移，從而使內(nèi)膜增厚。此外，Wnt信號(hào)通路可調(diào)節(jié)炎癥和泡沫細(xì)胞的形成，病理性血管形成和鈣化，這是斑塊形成和穩(wěn)定的關(guān)鍵能力〔2〕。而Dickkopf (DKK)-1是Wnt信號(hào)通路中重要的拮抗分子之一，能夠特異地抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路〔2〕。VSMC是血管壁主要細(xì)胞成分之一，對(duì)血管形態(tài)和功能起著重要作用〔3〕。各種血管疾病如高血壓及AS等，其發(fā)生發(fā)展的共同病理特征是VSMC增殖和遷移及表型轉(zhuǎn)化〔4〕。許多細(xì)胞因子和血液中的某些成分可促進(jìn)VSMC增殖，VSMC增殖過程中表型由收縮型向合成型轉(zhuǎn)變。研究表明DKK-1引發(fā)了動(dòng)脈斑塊炎癥反應(yīng)，在頸動(dòng)脈內(nèi)斑塊中DKK-1表達(dá)有所增加〔5〕。血清中DKK-1濃度與冠狀動(dòng)脈鈣化和AS斑塊相關(guān)〔6，7〕，但DKK-1對(duì)VSMC增殖、遷移及表型轉(zhuǎn)化的影響尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。本文擬研究DKK-1對(duì)SD大鼠VSMC增殖、遷移及表型轉(zhuǎn)化的影響。

1材料與方法

1.1材料新生牛血清(NCS)(杭州四季青生物工程材料有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)；胰蛋白酶(上海生化西巴斯公司)；外源DKK-1(美國R&D公司)；Trizol RNA試劑、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試劑和骨橋蛋白(OPN)引物(上海生物工程公司)；cck8試劑盒(DOjinDO公司)。

1.2VSMC培養(yǎng)取體質(zhì)量150～200 g健康SD大鼠2只，無菌取主動(dòng)脈，去除周圍多余的脂肪組織和外周組織，用D-Hanks液沖洗。縱向剪開血管，去內(nèi)膜，從中分離中膜，在盛少量DMEM的無菌瓶中剪成小塊，用吸管將組織塊移入50 cm2培養(yǎng)瓶中，并均勻貼于培養(yǎng)瓶底，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)6～8 h后，再加入含15%新生牛血清(NCS)的含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基(DMEM)繼續(xù)靜置培養(yǎng)，隔一天半量換液一次。生長到亞融合狀態(tài)后，在37℃、5%CO2條件下用0.25%胰蛋白酶消化培養(yǎng)5 min。實(shí)驗(yàn)選取第4～5代的細(xì)胞。

1.3cck-8分析細(xì)胞增殖取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞融合達(dá)90%左右的細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次，用0.25%胰蛋白酶液消化，等體積20%胎牛血清(FBS)培養(yǎng)液中止消化。將收集的終止液1 500 r/min離心5 min，棄離心液，然后用含20% FBS的DMEM培養(yǎng)液重新懸浮，制備單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞的濃度調(diào)為5×105ml-1。取上述調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸液100 μl接種到96孔板中，將培養(yǎng)板置于37℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)24 h。PBS洗滌兩次，無FBS培養(yǎng)液100 μl饑餓過夜。吸凈培養(yǎng)液，PBS液洗滌2次，實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組：含有20% FBS的DMEM培養(yǎng)液100 μl；實(shí)驗(yàn)組：分別加入20% FBS的DMEM培養(yǎng)液及DKK-1共100 μl(DKK-1濃度分別為0.5、1.0、1.5 μmol/L)，置于37℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)24 h，每孔板設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。加入10 μl cck-8溶液，2 h后測(cè)定在450 nm波長下的吸光度值。計(jì)算細(xì)胞增殖率并繪制曲線觀察細(xì)胞增殖情況，細(xì)胞增殖率=(處理組A450 nm值/對(duì)照組A450 nm值)×100%。

1.4transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)在 transwell小室上層加入調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸液100 μl，下層加入DKK-1分為正常對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組。其中正常對(duì)照組含20% FBS的DMEM培養(yǎng)液800 μl；實(shí)驗(yàn)組分別加入20% FBS的DMEM培養(yǎng)液及DKK-1共800 μl(DKK-1濃度分別為0.5、1.0、1.5 μmol/L)。在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞遷移結(jié)束后，小心取出transwell小室，用棉簽去除膜上層表面未遷移的細(xì)胞，膜上層向下浸泡在4%多聚甲醛中4℃固定30 min，然后用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗去膜表面浮色，顯微鏡下觀察，隨機(jī)選擇9個(gè)視野(200×)計(jì)算遷移的細(xì)胞數(shù)目。

1.5實(shí)驗(yàn)分組將4～5代VSMC接種到不同的培養(yǎng)器皿中。在37℃，5% CO2條件下用含10% NCS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。等細(xì)胞生長到70%～80%后，換成無血清培養(yǎng)基進(jìn)行24 h饑餓培養(yǎng)，然后用DKK-1刺激細(xì)胞。以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h的VSMC作為對(duì)照組。

1.6RT-PCR檢測(cè)OPN mRNA表達(dá)用Trizol試劑盒提取總RNA，取每組總RNA各1 μg以逆轉(zhuǎn)錄酶在20 μl反應(yīng)體系中42℃ 50 min，70℃ 15 min，逆轉(zhuǎn)錄mRNA為cDNA。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3 μl加入PCR體系，以Taq DNA聚合酶在50 μl反應(yīng)體系中進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。OPN：上游引物5′-AAG CCT GAC CCA TCT CAG AA-3′，下游引物5′-GCA ACT GGG ATG ACC TTG AT-3′；聚合酶鏈反應(yīng)：94℃變性50 s，56℃退火50 s，72℃延伸1 min，共32個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參。

1.7Western印跡檢測(cè)OPN蛋白表達(dá)提取細(xì)胞總蛋白，常規(guī)方法進(jìn)行蛋白免疫分析。每個(gè)樣品取40 μg蛋白進(jìn)行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入1∶400稀釋的羊抗人OPN多克隆抗體，4℃溫育12 h，β-actin作內(nèi)參照。TBST緩沖液洗膜3×10 min，加入1∶1 000稀釋的辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG，37℃孵育1 h，TBST緩沖液洗膜3×10 min，膜上均勻滴加ECL發(fā)光試劑，在暗室中壓片，顯影。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析，兩組間多重LSD-t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1DKK-1對(duì)VSMC增殖的影響不同濃度、不同作用時(shí)間DKK-1對(duì)VSMC細(xì)胞的生長有不同程度的抑制作用，隨著作用時(shí)間延長，DKK-1濃度增大，增殖率降低(P<0.05)，說明細(xì)胞增殖能力呈下降趨勢(shì)，提示DKK-1對(duì)VSMC有明顯的抑制增殖作用，而且抑制細(xì)胞增殖作用與DKK-1濃度和作用時(shí)間均呈明顯的依賴關(guān)系。不同作用濃度增殖率可以看出，24～48 h增殖率下降最為顯著，48～72 h較為平緩，故實(shí)驗(yàn)選擇48 h作為實(shí)驗(yàn)的最佳作用時(shí)間。見圖1。

2.2DKK-1對(duì)VSMC遷移的影響DKK-1處理組(0.5、1.0、1.5 μmol/L)細(xì)胞遷移穿膜細(xì)胞數(shù)(49、35、26)與空白對(duì)照組(61)相比降低，1.0、1.5 μmol/L組有明顯差異(P<0.01)，且在同一時(shí)間內(nèi)隨著DKK-1濃度的增加，細(xì)胞遷移能力也有所減低，由此說明DKK-1可抑制VSMC的遷移。

圖1　DKK-1對(duì)VSMC增殖的影響

2.3DKK-1對(duì)VSMC去分化相關(guān)基因OPN mRNA及蛋白表達(dá)的影響用DKK-1分別刺激 VSMC 24、48、72 h，與對(duì)照組(0.96)相比，DKK-1刺激時(shí)間的不斷延長，OPN mRNA(0.84、0.64、0.49)及蛋白水平明顯下降趨勢(shì)，48、72 h有明顯差異(P<0.01)，使細(xì)胞處于收縮型狀態(tài)，說明DKK-1能夠使VSMC向收縮表型轉(zhuǎn)化(圖2)。

圖2　DKK-1對(duì)VSMC中OPN蛋白表達(dá)的影響

3討論

在AS的發(fā)展過程中，VSMC的增殖、遷移及細(xì)胞外基質(zhì)增生是導(dǎo)致血管內(nèi)膜增生、管腔狹窄的重要病理生理機(jī)制〔6〕。VSMC由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化是其增殖及向血管內(nèi)膜遷移的重要起始步驟，是高血壓、AS 斑塊形成等血管重塑性疾病的細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)。因而，對(duì)VSMC 表型轉(zhuǎn)化過程及分子調(diào)節(jié)機(jī)制的研究，對(duì)上述疾病的防治具有非常重要的意義。

VSMC增殖、遷移及分化受許多調(diào)節(jié)因子形成的網(wǎng)絡(luò)所調(diào)控。DKK-1是一種Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的協(xié)同受體，它能抑制通路的激活。而Wnt信號(hào)通路的異常激活能促進(jìn)一些常見惡性腫瘤細(xì)胞增殖和遷移。Qin等〔7〕發(fā)現(xiàn)DKK-1能夠通過DKK-1/Wnt/B-catenin促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和遷移。但DKK生物學(xué)功能仍然不能明確。在大多數(shù)人肝細(xì)胞癌組織中，DKK-1 mRNA及蛋白水平均高于對(duì)應(yīng)的癌旁肝組織〔8〕。還有一些實(shí)驗(yàn)表明 DKK-1 能夠抑制結(jié)腸癌、神經(jīng)母纖維瘤、子宮內(nèi)膜癌和絨毛膜癌等的增殖及遷移〔9～12〕。本研究觀察到，施加外源性DKK-1上調(diào)了VSMC的 DKK-1 表達(dá)水平，細(xì)胞增殖能力降低，遷移能力也有所減低，提示DKK-1 可抑制VSMC增殖和遷移，并呈時(shí)間和濃度依賴性。

VSMC增殖往往伴隨細(xì)胞從中膜甚至外膜進(jìn)入內(nèi)膜，參與新生內(nèi)膜的形成。內(nèi)膜增厚不僅會(huì)導(dǎo)致VSMC增殖和VSMC遷移，而且還促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成和表型轉(zhuǎn)換〔13〕。OPN為合成型(去分化型)VSMC的標(biāo)志基因，僅在合成型VSMC中表達(dá)，其表達(dá)量上調(diào)與下調(diào)標(biāo)志著合成型VSMC數(shù)量增加與減少，這種表達(dá)特點(diǎn)提示該蛋白可能參與VSMC表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控過程，從而影響VSMC增殖過程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DKK-1能夠使VSMC向收縮表型轉(zhuǎn)化。血管內(nèi)皮損傷后，可釋放出多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化及增殖，當(dāng)細(xì)胞由收縮型轉(zhuǎn)化為合成型后極易進(jìn)入細(xì)胞周期而發(fā)生增殖，從而由中膜向內(nèi)膜遷移。VSMC增殖、遷移和血管壁結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致內(nèi)膜的增厚，并引發(fā)AS〔14，15〕。本研究表明DKK-1不失為一個(gè)AS治療中抑制細(xì)胞增殖、遷移的有效靶點(diǎn)。

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〔2014-11-27修回〕

(編輯杜娟)

中圖分類號(hào)〔〕R363.2〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)24-7012-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.021