孫大鵬　李　瑩　韓冠英

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，遼寧　錦州　121001)

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白藜蘆醇通過c-FLIP蛋白影響乳腺癌細胞MDA-MB-231的生長和侵襲

孫大鵬李瑩韓冠英

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，遼寧錦州121001)

摘要〔〕目的觀察白藜蘆醇(RES)抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231生長和侵襲的作用是否是通過抑制c-FLIP的表達來實現(xiàn)的。方法重組腺病毒載體Ad-c-FLIP的構(gòu)建及鑒定、轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞，通過qRT-PCR、RT-PCR和Western印跡觀察c-FLIP的表達情況；MTT比色法檢測空白對照組；RES100 μg/ml組；100 μmol/L RES+Ad-GFP-c-FLIP組；Ad-GFP-c-FLIP組在24 h，48 h和72 h內(nèi)對乳腺癌細胞增殖的影響；流式細胞儀和Transwell實驗分別檢測各組在作用48 h后乳腺癌細胞的凋亡和侵襲情況；Western印跡檢測各組在作用48 h后caspase-3、-8、MMP-2、-9的表達情況。結(jié)果qRT-PCR、RT-PCR和Western印跡檢測結(jié)果顯示Ad-GFP-c-FLIP明顯增強c-FLIP的表達，而與Ad-GFP-c-FLIP組比較RES+Ad-GFP-c-FLIP組明顯抑制c-FLIP的表達；與Ad-GFP-c-FLIP組相比RES+Ad-GFP-c-FLIP組乳腺癌細胞的生長明顯被抑制(P<0.05)，并且隨時間的延長抑制作用明顯加大；與Ad-GFP-c-FLIP組相比RES+Ad-GFP-c-FLIP組乳腺癌細胞的侵襲能力明顯被抑制，而乳腺癌細胞的凋亡明顯增加(P<0.05)；Western印跡檢測結(jié)果顯示，作用48 h后與Ad-GFP-c-FLIP組比較白藜蘆醇+Ad-GFP-c-FLIP組MMP-2，-9表達被抑制，而caspase-3，-8表達被增強。結(jié)論RES可以通過降低c-FLIP的表達來抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231的生長和侵襲。

關(guān)鍵詞〔〕c-FLIP；白藜蘆醇；乳腺癌細胞

第一作者：孫大鵬(1978-)，男，主治醫(yī)師，博士，主要從事腫瘤藥物治療研究。

細胞FLICE抑制蛋白(c-FLIP)又名caspase-8抑制蛋白，它的高表達可以抑制腫瘤細胞的凋亡〔1〕。c-FLIP可以在人類很多腫瘤組織中過表達，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到十分重要的調(diào)控作用。當(dāng)c-FLIP基因在腫瘤組織中的表達被抑制時，腫瘤細胞對化療藥物的敏感性能夠明顯被提高，從而促進腫瘤細胞的凋亡。白藜蘆醇(RES)是一種廣泛存在于葡萄、虎杖、花生等植物性食物或藥物中的多酚類活性單體，RES具有一定的強抗氧化性、抗炎、保護神經(jīng)、抑制血小板聚集、凋亡誘導(dǎo)作用等功效。RES作為化學(xué)預(yù)防劑，還具有明顯的抗腫瘤功效〔2，3〕。前期研究證明RES可以促進乳腺癌細胞的凋亡，但RES的這種促進乳腺癌細胞凋亡的作用是否與cFLIP的表達有關(guān)尚不得而知。本研究擬觀察RES能否通過影響c-FLIP的表達，抑制乳腺癌細胞的生長。

1材料與方法

1.1材料人乳腺癌細胞系MDA-MB-231(中國科學(xué)院)；Leibovitz L-15培養(yǎng)基(Gibco)；RES(純度>99%)(Sigma公司)；Ad-c-FLIP及腺病毒載體(本實驗室保存)；二甲基亞砜(DMSO)(Sigma)；青霉素、鏈霉素(大連美羅)；DMEM，RPMI 1640(Hyclone)；四甲基耦氮唑藍(MTT)(Bioshar)；Annexin V-FITC/PI試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)；Real-Time PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。

1.2MDA-MB-231細胞的培養(yǎng)與傳代人乳腺癌細胞MDA-MB-231用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的Leibovitz L-15培養(yǎng)基，在無CO2、37℃飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天更換培養(yǎng)液，細胞呈上皮樣貼壁生長。待細胞增長至80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化1～2 min，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。當(dāng)細胞質(zhì)回縮、細胞間隙變大、細胞有變圓趨勢時，倒掉胰酶，加入適量含10%胎牛血清的Leibovitz L-15培養(yǎng)基，終止胰酶消化。用吸管反復(fù)吹打貼壁細胞，使細胞脫離瓶壁充分分散，將細胞懸液按1∶2稀釋，傳到新培養(yǎng)瓶中，每瓶加入5 ml左右的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3MTT法檢測乳腺癌細胞的增殖取對數(shù)期生長的乳腺癌MDA-MB-231細胞，胰蛋白酶消化，將細胞懸液接種于96孔板每孔200 μl，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。24 h后，待細胞融合達80%左右時加藥。實驗分組：①空白對照組；②RES 100 μg/ml組；③100 μmol/L RES+Ad-GFP-c-FLIP組；④Ad-GFP-c-FLIP組。每個濃度設(shè)4個平行孔，每孔體積為200 μl。藥物作用24 h、48 h和72 h后，加入MTT振蕩均勻，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4 h。吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，避光，恒溫振蕩器上振10 min，室溫孵育20 min。選擇490 nm波長，用酶標(biāo)儀檢測各孔光吸收值(OD)。

1.4流式細胞術(shù)檢測腫瘤細胞凋亡率取對數(shù)期生長的人乳腺癌MDA-MB-231細胞，以5×105/ml接種于培養(yǎng)瓶中，每孔2 ml，加入適量Leibovitz L-15培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液，分組：①空白對照組；②RES組(100 μg/ml)；③RES+Ad-GFP-c-FLIP組；④Ad-GFP-c-FLIP組。作用48 h后，收集細胞，離心10 min，棄上清，PBS洗滌，調(diào)整細胞濃度為1×106/ml。取195 μl細胞懸液于5 ml流式管中，加入5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻后間隔3 min，再加入10 μl 20 μg/ml的PI溶液，混勻后于室溫避光孵育10 min，加入300 μl結(jié)合緩沖液，輕輕混勻，流式細胞儀測定凋亡率。每樣本收集1×104個細胞的熒光信號，結(jié)果采用Win MDI 2.9分析處理。

1.5Transwell實驗檢測MDA-MB-231細胞的侵襲將Matrigel與L-15培養(yǎng)基按1∶4稀釋，在Transwell上室中加入40 μl的Matrigel稀釋液，37℃中孵育12 h，使膠凝固。各組MDA-MB-231細胞用含0.1% BSA的無血清培養(yǎng)基重新懸浮，調(diào)整細胞濃度2×105/ml。取100 μl細胞加入上室，500 μl含血清培養(yǎng)基加入下室，每組設(shè)3個復(fù)孔，于CO2孵箱培養(yǎng)48 h后，取出小室，用棉簽蘸取磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕擦掉上膜細胞，小室以甲醇固定15 min，PBS洗滌3次，每次5 min；結(jié)晶紫染色15 min，PBS洗滌3次，每次5 min后鏡下觀察，每個濾膜隨機取5個視野(×100)，取均值計數(shù)，照相分析。

1.6Western印跡檢測相關(guān)蛋白的表達作用48 h后，收集各組細胞以冷PBS清洗2次，以裂解緩沖液提取總蛋白，蛋白濃度參照BCA試劑盒測定。煮沸變性的蛋白以每孔40 μg的含量加樣，經(jīng)濃縮膠為6%、分離膠為10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離。通過電轉(zhuǎn)儀將凝膠上的蛋白樣品移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉在37℃封閉2 h。 分別與1∶300兔抗人c-FLIP抗體；1∶400兔抗人caspase3、8抗體；1∶1 000兔抗人MMP2、9抗體；4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗鼠IgG(1∶200)山羊抗兔IgG(1∶200)，4℃孵育2 h。洗膜3次后用化學(xué)發(fā)光底物顯影，凝膠成像。

1.7Real Time PCR檢測相關(guān)基因的表達收集并計數(shù)各組細胞，按5×106個細胞加1 ml RNAiso Plus提取細胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計檢測RNA濃度，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行發(fā)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。c-FLIP：正義鏈5′GAAGGTGAAGGTCGGAGTC 3′，反義鏈5′ GAAGATGGTGATGGGATTTC 3′。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，進入PCR循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為95℃ 5 s，60℃ 30 s，循環(huán)45次，60℃收集熒光5 s，然后99℃ 1 min，55℃ 1 min，以0.5℃/s的速度升溫到99℃，連續(xù)監(jiān)測熒光做融解曲線分析。結(jié)果按照公式：△Ct=Ct(c-FLIP)-Ct(β-actin)，△△Ct=△Ct(Treated)-△Ct(Control)確定c-FLIP的相對表達水平。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，兩樣本的均數(shù)比較采用t檢驗。

2結(jié)果

2.1MDA-MB-231細胞Ad-GFP-c-FLIP的鑒定Ad-GFP-c-FLIP轉(zhuǎn)染48 h后，分別行RT-PCR、qRT-PCR和Western印跡檢測c-FLIP的表達。 RT-PCR結(jié)果顯示，與空白對照組和Ad-GFP陰性對照組比較，Ad-GFP-c-FLIP 組c-FLIP mRNA表達水平明顯增高；Western印跡檢測結(jié)果顯示，與其他組相比，c-FLIP的蛋白表達在Ad-GFP-c-FLIP組明顯增高。見圖1。qRT-PCR結(jié)果顯示，與空白對照組(92.31±3.72)比較。Ad-GFP-c-FLIP 組c-FLIP的表達顯著增加(198.97±9.77,P<0.05)，而Ad-GFP陰性對照組c-FLIP的表達無明顯差異(99.01±3.72,P>0.05)。

2.2RES和(或)Ad-GFP-c-FLIP對MDA-MB-231細胞增殖的影響培養(yǎng)24、48和72 h后，MTT法檢測結(jié)果顯示：與空白對照組相比，Ad-GFP-c-FLIP組促進MDA-MB-231細胞的生長，并且隨著時間的延長這種促進作用被進一步加強(P<0.05)；與空白對照組相比，RES組MDA-MB-231細胞生長明顯被抑制，且隨時間延長這種抑制作用被進一步加強(P<0.05)；與空白對照組相比，RES+Ad-GFP-c-FLIP組MDA-MB-231細胞生長無明顯變化(P>0.05)。而與Ad-GFP-c-FLIP組相比，RES和RES+Ad-GFP-c-FLIP組MDA-MB-231細胞的生長被抑制，并與時間呈正比(P<0.05)。說明RES可能是通過影響c-FLIP表達來抑制MDA-MB-231細胞的生長。見表1。

圖1　MDA-MR-231細胞c-FLIP表達情況

組別對照組RES組RES+Ad-c-FLIP組Ad-c-FLIP組24h20.79±3.0646.56±4.8221.31±3.3314.01±0.9248h21.22±2.2153.41±4.0923.67±3.2111.21±0.7172h24.67±2.7661.87±4.9926.62±2.879.35±0.88

2.3RES和(或)Ad-GFP-c-FLIP對MDA-MB-231細胞凋亡的影響作用48 h后，收集各組細胞，AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色該轉(zhuǎn)染條件下各組細胞，流式細胞儀分析可見，與空白對照組〔(15.94±1.02)%〕相比,Ad-GFP-c-FLIP組抑制MDA-MB-231細胞的凋亡〔(3.53±0.11)%，P<0.05〕；與空白對照組相比，RES組〔(28.8±1.79)%〕促進MDA-MB-231細胞的凋亡(P<0.05)；而RES+Ad-GFP-c-FLIP組〔(16.23±1.43)%〕與空白對照組相比MDA-MB-231細胞的凋亡情況無明顯差距(P>0.05)。與Ad-GFP-c-FLIP組相比，RES組和RES+Ad-GFP-c-FLIP組均促進MDA-MB-231細胞的凋亡(P<0.05)，說明RES可能是通過抑制c-FLIP的表達來促進MDA-MB-231細胞的凋亡。

2.4RES和(或)Ad-GFP-c-FLIP對MDA-MB-231細胞侵襲能力的影響作用48 h后，與空白對照組(207±6)相比，RES組MDA-MB-231細胞的侵襲能力明顯下降(93±3，P<0.05)；Ad-GFP-c-FLIP組MDA-MB-231細胞的侵襲能力增強(309±8，P<0.05)；RES+Ad-GFP-c-FLIP組細胞的侵襲能力無明顯改變(222±6，P>0.05)。與Ad-GFP-c-FLIP組相比，RES和RES+Ad-GFP-c-FLIP組MDA-MB-23細胞的侵襲能力均明顯降低(P<0.05)，說明RES可能是通過降低c-FLIP的表達來抑制MDA-MB-231細胞的侵襲能力。

2.5RES和(或)Ad-GFP-c-FLIP對MDA-MB-231細胞中c-FLIP表達的影響與空白對照組(108.24±5.36)相比，Ad-GFP-c-FLIP組(177±8.96)c-FLIP的表達明顯被增強，而RES組c-FLIP的表達均被抑制(39.87±4.22，P<0.05)；與空白對照組相比，RES+Ad-GFP-c-FLIP組c-FLIP的表達無明顯變化(121.06±6.02，P>0.05)。與Ad-GFP-c-FLIP組相比，RES組和RES+Ad-GFP-c-FLIP組c-FLIP的表達均被抑制(P<0.05)。該結(jié)果表明RES可以抑制c-FLIP的表達。見圖2。

2.6RES和(或)Ad-GFP-c-FLIP對caspase-3、-8和MMP-2、-9蛋白表達的影響與空白對照組比較，RES組caspase-3、-8蛋白的表達增強，而MMP-2、-9蛋白的表達則被抑制；與空白對照組比較，Ad-GFP-c-FLIP組caspase-3、-8蛋白的表達被抑制，而MMP-2、-9蛋白的表達則被增強；與空白對照組相比，RES+Ad-GFP-c-FLIP組caspase-3、-8和MMP-2、-9的蛋白表達無明顯變化。見圖3。

圖2　MDA-MB-231細胞c-FLIP的表達情況

圖3　Western印跡檢測caspase-3、-8和MMP-2、-9的蛋白表達情況

3討論

c-FLIP 是一種 DED 調(diào)節(jié)蛋白，又名caspase-8抑制蛋白。它可以阻止caspase-8 與死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物(DISC)結(jié)合，使caspase-8 不能被充分激活，進而抑制了caspase-8殺傷腫瘤細胞的作用〔4〕。研究表明，很多化療藥物的抗腫瘤作用是通過抑制c-FLIP的表達來得以實現(xiàn)的。RES屬非黃酮類多酚化合物，在自然界中廣泛存在，我們前期研究已經(jīng)證明RES可以抑制乳腺癌細胞的生長和侵襲〔5〕，但具體機制尚不清楚。本研究結(jié)果顯示：RES可以明顯抑制Ad-GFP-c-FLIP促進乳腺癌MDA-MB-231細胞生長的作用，并且這種作用隨著時間的延長變得越發(fā)明顯；同時RES和Ad-GFP-c-FLIP聯(lián)合作用時RES可以抑制Ad-GFP-c-FLIP增強c-FLIP表達的作用。因此，本研究認為RES可以抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞中c-FLIP的表達。caspase家族是凋亡的主要執(zhí)行者〔6〕，其中caspase-8屬起始caspase，caspase-3屬效應(yīng)caspase，是caspase級聯(lián)反應(yīng)中重要的效應(yīng)酶之一〔7〕。本研究結(jié)果顯示，Ad-GFP-c-FLIP可以抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡，降低caspase-3，-8的表達；而當(dāng)RES與Ad-GFP-c-FLIP聯(lián)合使用時RES可以明顯降低Ad-GFP-c-FLIP抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡的作用，增強caspase-3，-8的表達，說明RES可以通過抑制c-FLIP來增強caspase-3，-8的表達，進而促進乳腺癌MDA-MB-231細胞的凋亡?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)幾乎能降解細胞外基質(zhì)(ECM) 中的各種蛋白成分，進而破壞腫瘤細胞侵襲的組織學(xué)屏障，這在腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中起到十分重要的作用〔8～10〕。本研究說明RES可以通過c-FLIP來抑制MMP-2，-9的表達，進而抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。綜上，RES可以抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的生長，而這種抑制作用很可能是通過c-FLIP信號途徑來實現(xiàn)的。

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〔2014-03-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

通訊作者：韓冠英(1976-)，男，副教授，博士，主要從事腫瘤藥物治療研究。

基金項目：遼寧省自然科學(xué)基金(2014022044)

中圖分類號〔〕R737.9〔

文獻標(biāo)識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)24-6998-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.014