沈　薇　隋　璐　趙　慧　王麗媛

(沈陽醫(yī)學院病理生理教研室，遼寧　沈陽　110034)

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饑餓誘導胃癌細胞自噬發(fā)生及Beclin-1表達的變化

沈薇隋璐趙慧1王麗媛2

(沈陽醫(yī)學院病理生理教研室，遼寧沈陽110034)

摘要〔〕目的探討?zhàn)囸I誘導胃癌細胞MKN1自噬的發(fā)生及自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達的變化。方法培養(yǎng)胃癌細胞MKN1至對數(shù)生長期后，以無氨基酸培養(yǎng)液EBSS代替RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)12h后收集細胞，應用Western印跡和定量PCR(qRT-PCR)方法分別檢測特異性標記自噬的微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B(LC3B)以及自噬相關(guān)蛋白Beclin-1的蛋白和mRNA表達。免疫熒光檢測饑餓誘導后細胞自噬體的產(chǎn)生。結(jié)果饑餓處理12 h后，Western印跡和qRT-PCR 檢測LC3B和Beclin-1蛋白和mRNA表達與對照組比較均明顯增加(P<0.05)。免疫熒光下可見點狀自噬體。結(jié)論饑餓可以誘導胃癌細胞MKN1發(fā)生自噬，Beclin-1與饑餓誘導胃癌細胞MKN1的自噬相關(guān)，為進一步研究Beclin-1在胃癌細胞自噬中的作用機制奠定了基礎。

關(guān)鍵詞〔〕微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B；自噬；Beclin-1；饑餓；胃癌

1沈陽醫(yī)學院機能教研室

2沈陽醫(yī)學院2008級醫(yī)學檢驗專業(yè)學生

第一作者：沈薇(1976-)，女，博士，副教授，主要從事腫瘤生物學行為及其分子機制研究。

胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素和多階段演化的過程，目前認為可能與自噬和凋亡有關(guān)〔1〕。自噬作用是細胞在饑餓、能量缺乏等代謝壓力下的一種生理過程，細胞內(nèi)的蛋白、細胞器和胞質(zhì)通過自噬作用被包裹、消化并降解成核苷、氨基酸和脂肪酸循環(huán)利用，合成新的大分子和ATP〔2〕。自噬作用不僅具有維持細胞穩(wěn)態(tài)、促進細胞生存的作用，過度上調(diào)的自噬作用也可以引起細胞死亡，即“自噬性細胞死亡”，也稱為Ⅱ型程序化細胞死亡。自噬作用的調(diào)節(jié)異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)〔3，4〕，細胞自噬研究可能為惡性腫瘤的治療提供更新的途徑。Beclin-1是近十多年來才發(fā)現(xiàn)的與自噬相關(guān)的一種抑癌基因，它通過誘導自噬而抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展〔5〕，但其在胃癌細胞自噬中的具體作用及其機制尚不清楚。本研究采用Earle′s平衡鹽緩沖液(EBSS)代替培養(yǎng)液處理人胃癌細胞MKN1，免疫熒光及蛋白質(zhì)印跡法檢測自噬的標記蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B(LC3B)和自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達的變化，以進一步探討胃癌中自噬作用的分子機制。

1材料與方法

1.1材料胃癌細胞MKN1由本實驗室保存。RPMI 1640培養(yǎng)基，10%胎牛血清(GFBS)，EBSS均購自美國Gibco公司；AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司；兔抗人β-actin，Beclin-1單克隆抗體，羊抗人LC3B多克隆抗體，羊抗兔，驢抗羊辣根過氧化物酶IgG購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；增強型化學發(fā)光試劑(ECL)購自美國Pierce公司；Trizol購自美國Invitrogen公司；SYBR Green I Master 購自日本Takara公司。

1.2細胞培養(yǎng)及處理MKN1細胞在含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)至70%～80%細胞融合，對數(shù)生長期時，實驗組細胞以EBSS洗3遍后，以EBSS代替RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)(饑餓處理)，并在12 h后收獲細胞或進行相關(guān)檢測。對照組細胞不施加處理因素。

1.3免疫熒光觀察饑餓誘導后自噬體的形成MKN1細胞培養(yǎng)于24孔板內(nèi)，孔內(nèi)事先置入無菌蓋玻片。取正常對照細胞和EBSS培養(yǎng)12 h的細胞，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定，10%BSA(0.2% TritonX-100)封閉，加入一抗(LC3B，滴度為1∶1 000)，常溫下孵育2 h，PBS清洗3次，加入熒光標記二抗 Alexa488(Invitrogen 公司，1∶800)常溫下孵育1 h，甘油封片。于熒光顯微鏡下觀察。

1.4實時熒光定量RT-PCR 檢測LC3B和Beclin-1 mRNA表達以Trizol法提取實驗和對照組細胞總RNA，并用紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度(A260/A280>1.9)。根據(jù)濃度取1 μg總RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行PCR擴增。LC3B上游引物5′-CAACATGAGCGAGTTGGTCAAGA-3′，下游引物5′-ACTCACCATGCTGTGCTGGTTC-3′;Beclin-1上游引物5′-ATGCAGGTGAGCTTCGTGTG-3′，下游引物5′-CTGGGCTGTGCTAAGTAATGGA-3′;GAPDH上游引物5′-AACGGATTTGGTCGTATTGGG-3′，下游引物5′-TCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′。以上引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。在無菌去酶的Eppendorf 管中按照說明書將配置好的real-time PCR反應液(反應總體積為20 μl)離心數(shù)秒，混勻后迅速置入ABI7500熒光定量PCR儀中，反應條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，34個循環(huán)，加溶解曲線。獲得各樣本待測基因的Ct值。采用2-ΔΔCt法進行試驗數(shù)據(jù)處理，其結(jié)果代表各目的基因表達的相對定量，以對照組作為矯正樣本。

1.5Western印跡檢測LC3B和Beclin-1表達收集對照組、饑餓誘導組細胞總蛋白，將蛋白煮沸5 min 使其變性，取處理后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，羊抗LC3B多克隆抗體(1∶500)，兔抗Beclin-1單克隆抗體(1∶500)或兔抗β-actin抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜，TBST洗膜，驢抗羊(1∶2 000)或羊抗兔(1∶2 000)辣根過氧化物酶IgG室溫孵育1 h，TBST洗膜，暗室中加入ECL液孵育后，利用凝膠電泳成像系統(tǒng)進行讀片分析。

2結(jié)果

2.1免疫熒光顯示饑餓誘導后細胞內(nèi)自噬體形成熒光顯微鏡下可見，對照組與實驗組中細胞均顯現(xiàn)綠色熒光。MKN1細胞經(jīng)饑餓處理12 h后，多數(shù)細胞出現(xiàn)點狀聚集的自噬體，而對照組無此現(xiàn)象(圖1)。

圖1　饑餓誘導MKN1細胞后自噬體的形成(×40)

2.2實時定量RT-PCR檢測LC3B和Beclin-1 mRNA表達LC3B mRNA 及Beclin-1 mRNA在饑餓處理12 h后表達(0.982±0.027，0.678±0.031)較對照組明顯增高(0.463±0.019，0.135±0.056，P<0.05)。

2.3Western印跡檢測LC3B和Beclin-1蛋白表達饑餓處理12 h后，與對照組LSC3BⅡ/LC3BⅠ灰度比值(0.13±0.32)比較，實驗組LC3BⅡ/LC3BⅠ灰度比值(0.68±0.14)明顯增加(P<0.05)，Beclin-1蛋白表達在饑餓處理后顯著增高〔(0.56±0.24)vs(1.67±0.15)，P<0.05〕，見圖2。

圖2　饑餓處理后MKN1細胞LC3B和Beclin-1蛋白表達

3討論

自噬作用參與多種生理過程中，在應激或饑餓狀態(tài)下，可通過分解胞質(zhì)內(nèi)生物大分子為自身生存提供所需營養(yǎng)，也是清除細胞內(nèi)長半衰期蛋白、衰老細胞器和受損結(jié)構(gòu)的主要分子過程，還是細胞對不良環(huán)境的一種防御機制。自噬或調(diào)解自噬的某一環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都可能導致疾病發(fā)生。自噬作用的調(diào)節(jié)異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。實驗研究發(fā)現(xiàn)，自噬作用是一種腫瘤抑制機制。有報道鼠的胰腺細胞經(jīng)致癌物質(zhì)誘導后，癌變前期細胞的自噬及降解能力增加，但當形成癌細胞后自噬能力下降〔4〕。多種腫瘤存在Beclin-1等自噬基因的缺陷，能夠逃避自噬性死亡〔6〕。細胞自噬研究可能為惡性腫瘤的治療提供更新的途徑。

在哺乳動物細胞中，LC3B的修飾過程對自噬泡的形成起關(guān)鍵作用。LC3B前體形成后，在細胞質(zhì)內(nèi)通過加工生成胞質(zhì)可溶性蛋白LC3B-I。當自噬發(fā)生的時候，自噬相關(guān)基因Atg7活化LC3B-Ⅰ，活化的LC3B-Ⅰ被轉(zhuǎn)運至E2樣酶Atg3，經(jīng)其泛素化修飾后能夠與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合成膜結(jié)合形式LC3B-Ⅱ〔7〕。由于LC3B-Ⅱ定位于自噬前體和自噬體，因此，目前認為LC3B-Ⅱ是自噬體的標志分子〔8〕。饑餓法是誘導細胞自噬的一種經(jīng)典方法，在肝癌〔9〕、前列腺癌〔10〕等腫瘤細胞的自噬研究中均有應用。本研究顯示細胞出現(xiàn)多個明亮的綠色熒光斑點，即自噬體形成，證實饑餓可以誘導胃癌細胞自噬發(fā)生。

另外，哺乳動物細胞發(fā)生自噬時，細胞內(nèi)LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ的轉(zhuǎn)化明顯增加，LC3B-Ⅱ的含量與自噬泡的數(shù)量成正比關(guān)系〔11〕。因此，通過Western印跡法來檢測LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化，可以方便地判斷自噬是被誘導還是被抑制，從而成為一種量化分析的依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細胞經(jīng)饑餓誘導后，除了可以觀察到大量點狀聚集的自噬體的形成，同時LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化明顯，這和Mizushima等〔12〕對GFP-LC3轉(zhuǎn)基因鼠的研究結(jié)果相一致。

Beclin-1是哺乳動物參與自噬的特異性基因，其機制主要是與Ⅲ型磷脂酰肌醇激酶(PI3K)形成復合物參與募集胞質(zhì)中含F(xiàn)YVE或PX基序的蛋白質(zhì)，用于自噬體膜的形成，并引導其它自噬蛋白定位于自噬體膜〔5〕。細胞過度表達Beclin-1可以誘導細胞自噬。Beclin-1在人類卵巢癌中下降了75%，在乳腺癌中下降了50%〔13〕。有報道上調(diào)Beclin-1的表達能夠增強順鉑誘導的胃癌細胞系MKN28凋亡，抑制Beclin-1的表達則削弱了順鉑的細胞毒作用〔14〕，提示Beclin-1的低表達在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起著一定的作用。本研究表明在胃癌細胞MKN1發(fā)生自噬的同時，能夠檢測到自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達的上調(diào)，說明Beclin-1表達上調(diào)與胃癌細胞自噬關(guān)系密切。

本研究成功采用饑餓法誘導胃癌細胞MKN1產(chǎn)生自噬，檢測了自噬的標記蛋白LC3B的變化，建立了胃癌自噬的細胞模型。同時檢測了自噬相關(guān)蛋白Beclin-1的表達變化，結(jié)果顯示Beclin-1與胃癌細胞的自噬相關(guān)。這為進一步研究自噬對胃癌細胞活性的影響及自噬的作用機制奠定了基礎。

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〔2014-08-11修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

基金項目：遼寧省教育廳杰出青年學者成長計劃(No.LJQ2012091)；沈陽醫(yī)學院優(yōu)秀人才啟動基金(No.20123041)

中圖分類號〔〕R730.261〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)24-6994-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.012