王璐璐　逄曙光　田玉玲　于　麗　史　蕊　丁　琳　王　燕

(山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院，山東　濟(jì)南　250013)

?

非肥胖糖尿病鼠的致糖尿病T細(xì)胞與年齡的相關(guān)性

王璐璐逄曙光田玉玲于麗史蕊1丁琳2王燕2

(山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院，山東濟(jì)南250013)

摘要〔〕目的研究非肥胖糖尿病(NOD)鼠是否帶有致糖尿病的T細(xì)胞及其致糖尿病能力是否隨著NOD鼠年齡增長(zhǎng)而增加。方法用NOD鼠和NOD背景的轉(zhuǎn)基因鼠為動(dòng)物模型，通過(guò)過(guò)繼轉(zhuǎn)移將不同周齡的NOD鼠T細(xì)胞轉(zhuǎn)移到T細(xì)胞缺陷的NOD鼠(即NOD.scid鼠)和在β細(xì)胞上表達(dá)共刺激分子CD80的NOD.scid鼠(即NOD.scid.Rip.B7鼠)。觀察過(guò)繼轉(zhuǎn)移后誘導(dǎo)受鼠糖尿病的發(fā)病率及各受鼠組發(fā)病率。結(jié)果(1)80%的NOD.scid.Rip.B7鼠在轉(zhuǎn)移脾細(xì)胞11 w后發(fā)生糖尿病，而NOD.scid受鼠在轉(zhuǎn)移后20 w尚沒有1例受鼠發(fā)生糖尿??；(2)在轉(zhuǎn)移后同一時(shí)間，不同周齡的NOD供鼠在相同受鼠中誘導(dǎo)的糖尿病發(fā)病率差異顯著(P<0.001)；不同周齡的受鼠糖尿病發(fā)病率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論(1)幼年NOD鼠的胰島沒有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)是因?yàn)棣录?xì)胞特異性的T細(xì)胞數(shù)有限，其致糖尿病能力隨著NOD供體鼠年齡的增長(zhǎng)而增加；(2)在胰島炎啟動(dòng)前，新生的和幼年的NOD.scid鼠就已經(jīng)表達(dá)與疾病有關(guān)的β細(xì)胞自身抗原。

關(guān)鍵詞〔〕CD8+T細(xì)胞；過(guò)繼轉(zhuǎn)移；1型糖尿?。籒OD小鼠；胰島炎

1泰山醫(yī)學(xué)院2山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院

第一作者：王璐璐(1987-)，女，碩士，住院醫(yī)師，主要從事糖尿病發(fā)病機(jī)制及并發(fā)癥影響因素的研究。

1型糖尿病(T1DM)是一種由T淋巴細(xì)胞進(jìn)行性損傷胰島β細(xì)胞導(dǎo)致胰島素生成減少而引起的自身免疫性疾病〔1〕。非肥胖糖尿病(NOD)小鼠是一種模擬人類T1D的動(dòng)物模型，在發(fā)病機(jī)制中有細(xì)胞免疫和體液免疫的參與，胰島內(nèi)有T淋巴細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞浸潤(rùn)〔2〕。研究顯示，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在T1DM發(fā)展中起著重要作用，均可作用于胰島β細(xì)胞抗原，使β細(xì)胞溶解〔3〕。因此，是T細(xì)胞介導(dǎo)了胰島β細(xì)胞的破壞。T1DM的發(fā)生同時(shí)需要CD4+T和CD8+T細(xì)胞的存在〔4〕。亦有研究表明，CD8+T細(xì)胞在胰島炎的發(fā)生中起關(guān)鍵作用〔5〕，但是幼年NOD鼠是否帶有致糖尿病的T細(xì)胞、其致糖尿病能力是否隨著供鼠年齡的增長(zhǎng)而增加，目前并不十分清楚。本研究擬觀察CD8+T細(xì)胞致糖尿病能力是否與NOD供鼠年齡呈正相關(guān)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物NOD鼠和NOD.scid鼠購(gòu)自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心和Jackson實(shí)驗(yàn)室(BarHarbor,ME)，NOD.scid.Rip.B7鼠由Dr.D.Serreze友好提供(Jackson實(shí)驗(yàn)室，BarHarbor,ME)；NOD.scid鼠是將先天性T、B、NK細(xì)胞缺陷的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(scid)小鼠基因引進(jìn)NOD背景的小鼠；NOD.scid.Rip.B7轉(zhuǎn)基因鼠是在胰島的β細(xì)胞上大鼠胰島素促進(jìn)子(Rip)下游特異性表達(dá)B7-1(CD80)基因的NOD.scid鼠。

1.1.2主要試劑紅細(xì)胞裂解液：Beyotime公司生產(chǎn)，產(chǎn)品編號(hào)C3702；磷酸鹽緩沖液(PBS)：Invitrogen公司生產(chǎn)，貨號(hào)Cat No.14200-075；蛋白酶K(20 mg/ml)：Invitrogen公司生產(chǎn)，貨號(hào)Cat No.25530-049；上樣緩沖液：Invitrogen公司生產(chǎn)，Lot No.1127020；DNA Taq polymerase:Invitrogen公司生產(chǎn)，Cat.No.18038-042。Rip.B7引物序列：Rip.B7-F35:5′-TGA AGC CAT GGG CCA CAC-3′；Rip.B7-R36:5′-GAC ACT GTT ATA CAG GGC-3′。

1.2方法

1.2.1脾細(xì)胞的制備將新鮮脾用兩塊滅菌載玻片的毛邊研磨碎，4℃，離心5 min，棄上清；加紅細(xì)胞裂解液2.5 ml/脾，混勻后立即4℃，離心5 min，棄上清；洗去紅細(xì)胞裂解液，4℃，離心5 min，去上清；用PBS將白細(xì)胞充分懸浮，計(jì)數(shù)白細(xì)胞。

1.2.2小鼠基因型的鑒別利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法鑒定B7基因型；用流式細(xì)胞分析技術(shù)鑒定NOD、NOD.scid。

1.2.3過(guò)繼轉(zhuǎn)移試驗(yàn)(1)從14天齡的幼年NOD鼠分離脾細(xì)胞，調(diào)整懸浮細(xì)胞使其濃度為10×107個(gè)脾細(xì)胞/ml。35只6～8周齡(成年鼠)的NOD.scid.Rip.B7作為受鼠，36只年齡與之匹配的NOD.scid鼠作為對(duì)照，取200 μl懸浮的脾細(xì)胞(含2×107個(gè)脾細(xì)胞)，分別腹腔注射給每一只受鼠，監(jiān)測(cè)受鼠糖尿病的發(fā)生。同樣方法，分別將相同數(shù)量來(lái)自3、4、6周齡NOD鼠的脾細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移給6～8周齡(成年鼠)的NOD.scid，測(cè)定血糖，尾靜脈取血監(jiān)測(cè)受鼠糖尿病的發(fā)生。(2)從10～12周齡糖尿病前期的NOD鼠分離脾細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞后，用冰PBS懸浮細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為10×107個(gè)脾細(xì)胞/ml。將新生的(n=30)以及1周齡(n=32)、2周齡(n=34)、3周齡(n=32)、6周齡(n=36)的NOD.scid鼠作為受鼠，取100 μl懸浮的脾細(xì)胞(含1×107個(gè)脾細(xì)胞)，分別腹腔注射給每一只受鼠，尾靜脈取血監(jiān)測(cè)受鼠糖尿病的發(fā)生。

1.2.4糖尿病和胰島炎的評(píng)估當(dāng)連續(xù)2 d測(cè)定血糖均>16.7 mmol/L時(shí)評(píng)定為糖尿病。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，切除尚未發(fā)生糖尿病小鼠的胰腺，用10%甲醛固定，石蠟包埋，每間隔100 μm連續(xù)非重疊性切片并HE染色，評(píng)定胰島炎。胰島評(píng)分：正常胰島(無(wú)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn))，胰島外周炎(淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)在胰島周圍)，胰島炎(淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)至胰島內(nèi))。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS18.0軟件，兩樣本率的比較采用四格表資料的χ2檢驗(yàn)，多樣本率的比較采用行×列表資料的χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1幼年NOD鼠與致糖尿病T細(xì)胞幼年NOD鼠的胰島內(nèi)沒有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)并非因?yàn)槿狈?nèi)源性自身抗原，而是因?yàn)棣录?xì)胞特異性的T細(xì)胞數(shù)有限。在轉(zhuǎn)移脾細(xì)胞9 w后，當(dāng)大部分(68.6%)NOD.scid.Rip.B7受鼠發(fā)生糖尿病時(shí)，在NOD.scid受鼠組尚沒有檢測(cè)到胰島淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。轉(zhuǎn)移脾細(xì)胞后11 w，80%的NOD.scid.Rip.B7鼠發(fā)生糖尿病，而在NOD.scid對(duì)照組，即使轉(zhuǎn)移脾細(xì)胞后20 w仍然沒有1例受鼠發(fā)生糖尿病。

2.2不同年齡NOD鼠T細(xì)胞致糖尿病能力T細(xì)胞的致糖尿病能力隨著NOD供鼠年齡的增長(zhǎng)而增加。當(dāng)2×107個(gè)2周齡NOD鼠的脾細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移給6～8周齡的NOD.scid鼠時(shí)，轉(zhuǎn)移后20 w未見有受鼠發(fā)生糖尿病(n=36)；當(dāng)將2×107個(gè)3周齡NOD鼠的脾細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移給6～8周齡的NOD.scid鼠時(shí)，轉(zhuǎn)移后13 w時(shí)開始有受鼠發(fā)生糖尿病(5%)，轉(zhuǎn)移到15 w時(shí)有15%發(fā)生糖尿病，到轉(zhuǎn)移后25 w時(shí)有約30%的受鼠發(fā)生糖尿病(n=35)；當(dāng)將相同數(shù)量的4周齡NOD鼠的脾細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移給6～8周齡的NOD.scid鼠時(shí)，轉(zhuǎn)移后12 w時(shí)開始有受鼠發(fā)生糖尿病(10%)，13、15 w時(shí)分別有20%、40%的受鼠發(fā)生糖尿病，到轉(zhuǎn)移后20 w時(shí)有約50%的受鼠發(fā)生糖尿病(n=36)；而轉(zhuǎn)移相同數(shù)量的6周齡NOD鼠的脾細(xì)胞時(shí)，轉(zhuǎn)移5 w后(36 d)開始有NOD.scid受鼠發(fā)生糖尿病(7.5%)，到轉(zhuǎn)移7 w時(shí)有35%發(fā)生糖尿病，轉(zhuǎn)移后9 w時(shí)有約65%的受鼠發(fā)生糖尿病，轉(zhuǎn)移11、12 w時(shí)有80%、90%的受鼠發(fā)生糖尿病，轉(zhuǎn)移至13 w時(shí)100%受鼠均發(fā)生糖尿病(n=37)。

將不同周齡NOD鼠的脾細(xì)胞轉(zhuǎn)移給6～8周齡的NOD.scid鼠，2×107脾細(xì)胞/受鼠，T細(xì)胞的致糖尿病能力隨NOD供鼠年齡的增長(zhǎng)而增強(qiáng)(P<0.001)，見表1。

2.3幼年NOD鼠體內(nèi)存在β細(xì)胞自身抗原的表達(dá)從已發(fā)生糖尿病的NOD鼠分離脾細(xì)胞并注射給新生的(n=30)以及1周齡(n=32)，2周齡(n=34)，3周齡(n=32)，6周齡(n=36)的NOD.scid鼠。所有年齡組的受鼠均在接受轉(zhuǎn)移細(xì)胞后5 w左右開始發(fā)病，轉(zhuǎn)移后9 w時(shí)所有年齡組受鼠100%發(fā)病。盡管受鼠的年齡不同，但它們發(fā)生糖尿病的時(shí)間卻相似，見圖1，圖2，表2。

將已發(fā)生糖尿病的NOD鼠的脾細(xì)胞轉(zhuǎn)移給新生的以及1、2、3和6周齡的NOD.scid鼠，1×107脾細(xì)胞/受鼠。盡管受鼠的年齡不同，但它們發(fā)生糖尿病的時(shí)間卻相似(P>0.05)。

圖1　將NOD鼠分離的脾細(xì)胞腹腔注射到不同周齡的NOD.scid鼠后糖尿病的發(fā)病率

圖2　從14天齡的幼年NOD鼠分離脾細(xì)胞分別過(guò)繼轉(zhuǎn)移到NOD.scid.Rip.B7鼠和NOD.scid鼠后觀察過(guò)的糖尿病發(fā)病率

表1不同年齡NOD鼠的脾細(xì)胞轉(zhuǎn)移后13、15 w時(shí)，多個(gè)樣本率之間兩兩比較

組別比較13w樣本率之差(%)χ2值P值15w樣本率之差(%)χ2值P值3周齡與4周齡-13.733.02240.0821-24.605.48090.01923周齡與6周齡-94.2964.40440.0000-85.7154.36730.00004周齡與6周齡-80.5649.45010.00004-61.1132.36490.0000

表2糖尿病NOD鼠的脾細(xì)胞對(duì)不同年齡的NOD.scid鼠誘導(dǎo)的糖尿不同時(shí)間發(fā)生率(%)

受鼠周齡n3周4周5周6周7周8周9周新生鼠30006.723.353.393.31001周齡32006.328.156.393.81002周齡340011.829.458.891.21003周齡32006.32553.196.91006周齡3602.78.330.661.194.4100

3討論

在T1DM發(fā)病中，細(xì)胞免疫所起到的作用主要包括T細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等對(duì)胰島的浸潤(rùn)，誘發(fā)胰島炎，而T細(xì)胞對(duì)胰島的浸潤(rùn)和破壞是T1DM發(fā)病的中心環(huán)節(jié)〔6，7〕。大量研究表明，CD4+和CD8+T細(xì)胞是介導(dǎo)破壞β細(xì)胞的基礎(chǔ)〔4,8，9〕。這兩種T細(xì)胞協(xié)同導(dǎo)致了T1DM的發(fā)生。將14天齡NOD鼠的脾細(xì)胞轉(zhuǎn)移到NOD.scid鼠時(shí)，受鼠既不發(fā)生胰島炎也不發(fā)生糖尿病。這可能是由于T細(xì)胞總數(shù)和(或)致糖尿病性T細(xì)胞數(shù)有限所致。首先發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的推移，NOD.scid受鼠并沒有發(fā)生糖尿病，而NOD.scid.Rip.B7受鼠的糖尿病發(fā)病率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。由于在NOD.scid.Rip.B7鼠中可誘導(dǎo)發(fā)生糖尿病，說(shuō)明14天齡的NOD鼠的脾細(xì)胞含有β細(xì)胞特異性T細(xì)胞。但是，在NOD.scid受鼠中沒有胰島炎和糖尿病，也說(shuō)明了在幼年NOD鼠中的T細(xì)胞數(shù)量(或)致糖尿病能力不足以在沒有CD80的共同刺激作用時(shí)誘導(dǎo)糖尿病的發(fā)生。共刺激分子CD80在β細(xì)胞上的表達(dá)促進(jìn)NOD.scid.Rip.B7受鼠發(fā)生胰島炎這一事實(shí)表明致病性T細(xì)胞存在于幼年的NOD鼠，至少14天齡的NOD鼠體內(nèi)存在致病性T細(xì)胞。

然后，我們檢驗(yàn)了是否幼年NOD鼠體內(nèi)缺少β細(xì)胞自身抗原的表達(dá)。結(jié)果表明在胰島炎啟動(dòng)前，新生的和幼年的NOD.scid鼠就已經(jīng)表達(dá)與疾病有關(guān)的β細(xì)胞自身抗原。

人類和NOD小鼠的主要組織相容復(fù)合物(MHC)-Ⅱ類等位基因與T1DM易感性有強(qiáng)大的基因連鎖性〔10〕。在第6號(hào)染色體上的HLA-Ⅱ基因多態(tài)性被認(rèn)為是2型糖尿病最主要的遺傳位點(diǎn)〔11〕。因此，之前的研究〔12,13〕大多分析CD4+T細(xì)胞在糖尿病發(fā)病中的作用，在β細(xì)胞上表達(dá)共刺激分子CD80并不改變?chǔ)录?xì)胞的發(fā)育和功能，卻顯著促進(jìn)了糖尿病的發(fā)展〔14〕。然而，糖尿病發(fā)展的加速是否是胰島炎早期啟動(dòng)和β細(xì)胞破壞增強(qiáng)的結(jié)果尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)幼年NOD鼠的胰島沒有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)并非因?yàn)槿狈?nèi)源性自身抗原，而是因?yàn)棣录?xì)胞特異性的T細(xì)胞數(shù)有限，但是其致糖尿病能力隨著NOD供體鼠年齡的增長(zhǎng)而增加。T1DM的發(fā)病是遺傳與環(huán)境相互作用引發(fā)特異性自身免疫反應(yīng)，選擇性破壞胰島β細(xì)胞等一系列過(guò)程。自身免疫破壞由多種免疫細(xì)胞參與。本文結(jié)果并不能完全解釋糖尿病的發(fā)病機(jī)制，CD8+T細(xì)胞與其他免疫細(xì)胞相互作用對(duì)糖尿病發(fā)病的影響尚有待進(jìn)一步研究。最近的研究結(jié)果表明T細(xì)胞可作為預(yù)防T1DM的靶細(xì)胞〔15〕。因此，明確T細(xì)胞在T1DM發(fā)病中的作用機(jī)制，將從免疫調(diào)節(jié)的角度為T1DM的預(yù)防和治療提出新思路。

參考文獻(xiàn)4

1Abreu JRF,Roep BO.Immune monitoring of islet and pancreas transplant recipients〔J〕.Curr Diab Rep,2013；13(5):704-12.

2Kachapati K,Adams D,Bednar K,etal.The non-obese diabetic(NOD)mouse as a model of human type 1 diabetes〔J〕.Methods Mol Biol,2012；933(1):3-16.

3Diz R,Garland A,Vincent BG,etal.Autoreactive effector/memory CD4+and CD8+T cells infiltrating grafted and endogenous islets in diabetic NOD mice exhibit similar T cell receptor usage〔J〕.PLoS One,2012；7(12):52054.

4Phillips JM,Parish NM,Raine T,etal.Type 1 diabetes development requires both CD4+and CD8+T cells and can be reversed by non-depleting antibodies targeting both T cell populations〔J〕.Rev Diabet Stud RDS,2009；6(2):97-103.

5Pang S,Zhang L,Wang H,etal.CD8(+)T cells specific for beta cells encounter their cognate antigens in the islets of NOD mice〔J〕.Eur J Immunol,2009；39(10):2716-24.

6王知笑，楊濤，陳家偉.自身免疫性1型糖尿病相關(guān)的CD8+T細(xì)胞表位〔J〕.免疫學(xué)雜志，2011；27(5)：437-40.

7Hinman RM,Cambier JC.Role of B lymphocytes in the pathogenesis of type 1 diabetes〔J〕.Curr Diab Rep,2014；14(11):543.

8Coppieters KT,von Herrath MG.Viruses and cytotoxic T lymphocytes in type 1 diabetes〔J〕.Clin Rev Allergy Immunol,2011;41(2):169-78.

9Gutierrez DA,Fu W,Schonefeldt S,etal.Type 1 diabetes in NOD mice unaffected by mast cell deficiency〔J〕.Diabetes,2014;63(11):3827-34.

10De Riva A,Busch R.MHC class Ⅱ protein turn over in vivo and its relevance for autoimmunity in non-obese diabetic mice〔J〕.Front Immunol,2013；4(3):399.

11Xie Z,Chang C,Zhou Z.Molecular mechanisms in autoimmune type 1 diabetes:a critical review〔J〕.Clin Rev Allergy Immunol,2014；47(2):174-92.

12Perez S,Fishman S,Bordowitz A,etal.Selective immunotargeting of diabetogenic CD4 T cells by genetically redirected T cells〔J〕.Immunology,2014；143(4)：609-17.

13Unanue ER.Antigen presentation in the autoimmune diabetes of the NOD mouse〔J〕.Ann Rev Immunol,2014;32(5):579-608.

14Wong FS,Du W,Thomas IJ,etal.The influence of the major histocompatibility complex on development of autoimmune diabetes in RIP-B7.1 mice〔J〕.Diabetes,2005;54(7):2032-40.

15王弘珺，李質(zhì)馨，楊柳，等.Th1細(xì)胞在NOD小鼠糖尿病早期的應(yīng)用〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2012;32(4)：1411-2.

〔2015-02-17修回〕

(編輯李相軍)

Association of diabetogenic T lymphocytes and ages in NOD mice

WANG Lu-Lu,PANG Shu-Guang,TIAN Yu-Ling,etal.

Jinan Central Hospital Affiliated to Shandong University,Jinan 250013,Shandong,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate whether young non-obese diabetic(NOD)mice contain diabetogenic T lymphocytes and the diabetogenic capacity of T cells increased with the age of NOD mice.MethodsNOD mice and NOD background transgenic mice using genetic engineering were used as animal models.According to adoptive transferred experiments,T cells were transferred from NOD mice and NOD background mice to T cell-deficient NOD mice and T cell-deficient NOD mice with co-stimulating molecules CD80 expressed specific on islets β cells.The incidence of induced diabetes were investigated in the two recipients.ResultsDiabetes was induced in 80% of NOD.scid.Rip.B7 mice by 11 weeks post-transfer.In contrast,none of the NOD.scid recipients developed diabetes even by 20 weeks post-transfer.There was significant difference among the diabetes incidence induced by different age of NOD donor mice by the same time post-transfer(P<0.001). There was no significant difference among different age of recipient mice of the diabetes incidence induced by diabetic NOD donor mice by the same time post-transfer(P>0.05).ConclusionsSpleen cells of young NOD mice contain beta cell-specific T cells，however,the T cell repertoire and/or frequency of diabetogenic T cells are limited.The diabetogenic capacity of T cells is increased with the age of NOD mice.Beta cell antigens have been expressed in young NOD mice before starting the insulitis.

【Key words】CD8+T cells;Adoptive transfer experiments;Type 1 diabetes;Non-obese diabetic(NOD)mice;Insulitis

通訊作者：逄曙光(1966-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，主要從事糖尿病發(fā)病機(jī)制及并發(fā)癥影響因素的研究。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81170771,81101183,81270175)；山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2012GSF11803)；濟(jì)南市國(guó)際合作計(jì)劃項(xiàng)目(201011008)

中圖分類號(hào)〔〕R587.1〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)24-6989-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.010