何　筑　況時祥　張樹森　鄒家莉　楊　燕　崔冬冰

(貴陽市第三人民醫(yī)院，貴州　貴陽　550002)

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腦通湯對缺氧/復(fù)氧大鼠海馬神經(jīng)元Bcl-2、Bax和Caspase-3表達(dá)的影響

何筑況時祥1張樹森1鄒家莉1楊燕2崔冬冰2

(貴陽市第三人民醫(yī)院，貴州貴陽550002)

摘要〔〕目的探討腦通湯對缺氧/復(fù)氧(H/R)大鼠海馬神經(jīng)元Bcl-2、Bax和半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3表達(dá)的影響及防治海馬神經(jīng)元凋亡的作用機(jī)制。方法取培養(yǎng)9 d的海馬神經(jīng)元，隨機(jī)分為正常細(xì)胞組、H/R模型組、正常血清組、腦通湯大、中、小劑量含藥血清組。除正常細(xì)胞組以外，各組均缺氧24 h再復(fù)氧2 h造模。采用免疫組化檢測海馬神經(jīng)元Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)；實時熒光定量PCR法檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3基因的表達(dá)。結(jié)果免疫組化顯示：與正常細(xì)胞比較，模型組Bcl-2蛋白表達(dá)下降、Bax蛋白表達(dá)明顯升高、Bcl-2/Bax比值下調(diào)(P<0.05)。與模型組比較，腦通湯大、中、小劑量含藥血清組Bcl-2蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax比值明顯增高，Bax蛋白表達(dá)明顯下降，呈劑量依賴性(P<0.05)；但正常血清組上述指標(biāo)無顯著變化(P>0.05)。實時熒光定量PCR顯示：Bcl-2、Bax mRNA趨勢同蛋白表達(dá)一致，Caspase-3 mRNA趨勢同Bax mRNA表達(dá)一致。結(jié)論腦通湯可通過上調(diào)Bcl-2蛋白及基因表達(dá)和Bcl-2/Bax比值，抑制Bax及Caspase-3的過度表達(dá)，從而抑制H/R海馬神經(jīng)元凋亡。

關(guān)鍵詞〔〕腦通湯；缺氧/復(fù)氧；海馬神經(jīng)元；Bcl-2；Bax；半胱氨酸蛋白酶3

1貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院

2貴陽醫(yī)學(xué)院組織工程與干細(xì)胞實驗中心

第一作者：何筑(1986-),女，碩士，主要從事血管性癡呆的研究。

腦通湯是在金元時期著名醫(yī)家李東垣的益氣升陽法的代表方益氣聰明湯基礎(chǔ)上化裁而來，具有補(bǔ)氣升陽、化瘀通絡(luò)、潛降浮陽之功。本課題前期臨床及實驗證實〔1～4〕，本方不僅可以改善血管性癡呆(VD)早期患者認(rèn)知功能，改善VD大鼠學(xué)習(xí)及記憶能力，還可減輕VD大鼠海馬CA1區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。但本方干預(yù)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制尚不十分明確。本實驗擬觀察腦通湯對缺氧/復(fù)氧(H/R)后海馬神經(jīng)元Bcl-2、Bax、半胱氧酸蛋白酶(Caspase)-3表達(dá)的影響，揭示本方抑制海馬神經(jīng)元凋亡的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1動物出生24 h以內(nèi)SD大鼠，雄性，SPF 級，購自貴陽醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，合格證號：SCXK(黔)2012-0001。SD大鼠，雄性，SPF級，體重(200±20)g，購自予重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(渝)2012-0005。

1.2主要試劑、藥品及儀器L-谷氨酰胺，Neurobasal-A Medium，B27無血清添加劑均購于Gibco 公司；多聚-L-賴氨酸(PLL)、DMEM-F12培養(yǎng)基、0.25%胰酶、青、鏈霉素雙抗溶液均購于 HyCLone；胎牛血清(FBS，杭州四季青)；異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記羊抗兔IgG、兔抗鼠Bcl-2(批號BA0412)、兔抗鼠Bax(批號BA0315-1)均購于武漢博士德生物工程有限公司；PV-6001兩步法免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；臺盼藍(lán)染液(Sigma)；Trizol(批號1596-026，invitrogen公司)；SYBR Green PCR 試劑盒(批號K0223，Thermo公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號K1622，F(xiàn)ermentas公司)；異丙醇(批號80109218)、無水乙醇(批號100092680)、氯仿(批號10023419)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；水合氯醛(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；無糖DMEM(Gibco公司)；腦通湯由貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院中藥房提供；SW-CJ-1D超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；LD4-2低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；Galaxy170R三氣培養(yǎng)箱(英國New Brunswick)；CTH4-200熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；TE2000倒置顯微鏡(日本Nikon)；MIAS 圖像分析系統(tǒng)(四川大學(xué)圖像圖形研究所提供)，ABI-7300Real-time檢測儀(ABI公司)；TG-16M低溫冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；K30旋渦振蕩器(青浦瀘西儀器廠)；PRO200電動勻漿機(jī)(FLUKO)；Tanon 2500R全自動數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)、Tanon HE-120水平電泳槽、Tanon EPS300電泳儀均為上海天能公司；K2800核酸檢測儀(北京凱恩公司)。

1.3腦通湯含藥血清的制備腦通湯(組成：黃芪40 g、西洋參8 g、天麻20 g、水蛭24 g、葛根60 g)每劑方藥152 g，加水500 ml煎制，醇沉提取，高溫消毒，制成含生藥量為3.04 g/ml(大劑量腦通湯組)、1.52 g/ml(中劑量腦通湯組)、0.76 g/ml(小劑量腦通湯組)。SD大鼠60只，隨機(jī)分為正常對照組和大、中、小劑量腦通湯組，每組15只。參照《藥理實驗方法學(xué)》〔3〕換算出灌胃給藥量：大、中、小劑量腦通湯組分別為(15.2、7.6、3.8 g·kg-1·d-1)，正常對照組灌服生理鹽水10 ml·kg-1·d-1〔6〕)，2次/d，連續(xù)灌胃4 d，末次灌胃2 h后，10%水合氯醛(0.33 ml/100 g)麻醉，無菌股動脈采血，常溫靜置4 h，離心(3 000 r/min，20 min)，分離血清，混勻同組血清，0.22 μm微孔濾器過濾除菌，56℃水浴箱中滅活30 min，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)選擇10只出生24 h以內(nèi)SD大鼠，脫頸處死，浸泡于75%酒精中1 min，斷頭，于顯微鏡下剝離雙側(cè)海馬，放入預(yù)冷的D-hank液中沖洗2～3遍。將組織剪成1 mm3的組織塊，用移液槍轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，加入0.25%胰蛋白酶，消化15 min，消化完畢加入適量種植培養(yǎng)基(89%DMED-F12、10%胎牛血清和1%雙抗)，終止消化5 min，再200目篩網(wǎng)過濾制成細(xì)胞懸液，離心(800～1 000 r/min，5 min)，棄上清，加入適量種植培養(yǎng)基，吹打混勻制成細(xì)胞懸液。放入培養(yǎng)箱差速貼壁1 h后，臺盼藍(lán)拒染試驗染色計數(shù)，按1.0×105～1.0×106個/ml的密度接種于PLL包被過的六孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。24 h后，第一次全量換成無血清培養(yǎng)基(97%Neurobasal、2%B27和1% L-谷氨酰胺)繼續(xù)孵育，每隔2～3 d換液1次。

1.5海馬神經(jīng)元H/R模型的建立與分組取生長9 d的海馬神經(jīng)元，隨機(jī)分為正常細(xì)胞組：正常海馬神經(jīng)元；H/R模型組：海馬神經(jīng)元+H/R；正常血清組：海馬神經(jīng)元+H/R+正常血清；腦通湯大劑量含藥血清組：海馬神經(jīng)元+H/R+腦通湯大劑量含藥血清；腦通湯中劑量含藥血清組：海馬神經(jīng)元+H/R+腦通湯中劑量含藥血清；腦通湯小劑量含藥血清組：海馬神經(jīng)元+H/R+腦通湯小劑量含藥血清。除正常細(xì)胞組以外，均參考文獻(xiàn)〔5〕根據(jù)本課題的具體要求稍加改良，制備細(xì)胞H/R模型：用無糖DMEM洗滌2次，H/R模型組換液無血清培養(yǎng)基，其余四組于H/R時依次加入無FBS配制而成的含10%SD大鼠正常血清及含10%腦通湯大、中、小劑量含藥血清培養(yǎng)基(分別用89%的無EBS的DMEM培養(yǎng)基、1%雙抗和10%正常血清或10%不同劑量含藥血清配制而成)，將這五組全置入37℃三氣培養(yǎng)箱，持續(xù)通入(95%N2+5%CO2)混合氣體，流速保持在0.5 L/min，缺氧24 h后，H/R模型組換液無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，其余四組全量換液相應(yīng)含10%SD大鼠正常血清及10%腦通湯大、中、小劑量含藥血清培養(yǎng)基，再將這三組放回37℃、5%CO2培養(yǎng)箱持續(xù)孵育2 h。正常細(xì)胞組用無血清培養(yǎng)基正常培養(yǎng)26 h，不做任何處理。

1.6免疫組化檢測海馬神經(jīng)元 Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)采用免疫組化PowervisionTM二步法試劑盒操作。操作完成后，利用病理圖像采集系統(tǒng)采圖，每張切片隨機(jī)選取5個高倍(×400)陽性細(xì)胞視野；利用MIAS圖像分析系統(tǒng)對神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白進(jìn)行陽性細(xì)胞平均光密度值(OD值)的測定與分析。

1.7實時熒光定量PCR法檢測海馬神經(jīng)元Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA的表達(dá)各引物均由上海基爾頓生物科技有限公司設(shè)計。引物序列：Bcl-2上游：5′ GGGATGCCTTTGTGGAAC 3′，下游：5′ GTCTGCTGACCTCACTTG 3′，擴(kuò)增長度148 bp；Bax上游：5′ GGACGCATCCACCAAGAAG 3′，下游：5′ CTGCCACACGGAAGAAGAC 3′，擴(kuò)增長度 134 bp；Caspase-3：上游：5′ GGCATCTCCTGTGATTGG 3′，下游：5′ CTCAGCACTCTGGGAAAG 3′，擴(kuò)增長度 185 bp；內(nèi)參β-actin：上游：5′ GTCGGTGTGAACGGATTTG 3′，下游：5′ TCCCATTCTCAGCCTTGAC 3′，擴(kuò)增長度 181 bp。

按Trizol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后按照SYBR Green PCR 試劑盒說明，采用實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)(兩步法)進(jìn)行目的基因和內(nèi)參基因的PCR反應(yīng)。反應(yīng)總體積25 μl，PCR 反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性。95℃，10 min；變性 95℃，15 s；退火60℃，45 s，延伸60℃，1 min，總共40次循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束時由電腦自帶軟件與PCR反應(yīng)軟件ABI Prism 7300SDS Software自動輸出結(jié)果及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物生成曲線，運用2-△△CT方法計算樣本目的基因相對表達(dá)量〔6〕。公式如下：樣品目的基因△CT=樣品目的基因CT值-內(nèi)參基因CT值；△△CT=樣品目的基因△CT值-對照組△CT值。

2結(jié)果

2.1腦通湯對海馬神經(jīng)元H/R后 Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響免疫組化結(jié)果顯示：海馬神經(jīng)元Bcl-2、Bax蛋白陽性細(xì)胞染色呈棕黃色，主要存在于胞質(zhì)和突起，胞核有少許黃色顆粒。正常細(xì)胞組Bcl-2有大量陽性細(xì)胞表達(dá)、染色較深；而Bax蛋白沒有或僅有少量陽性細(xì)胞表達(dá)、染色較淺。與正常細(xì)胞組比較H/R，模型組Bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)減少，染色變淺及平均光密度值下降(P<0.05)；而Bax蛋白有大量陽性細(xì)胞表達(dá)，染色較深，平均光密度值表達(dá)明顯增加(P<0.05)，且Bcl-2/Bax 比值下調(diào)。與H/R模型組比較，腦通湯大、中、小劑量含藥血清組Bcl-2 陽性細(xì)胞表達(dá)逐漸增加，染色變深及平均光密度值均升高(P<0.05)，而Bax蛋白陽性細(xì)胞表達(dá)逐漸減少、染色變淺及平均光密度值表達(dá)均下降(P<0.05)，且Bcl-2/Bax 比值上調(diào)。腦通湯大劑量中藥組上述指標(biāo)顯著表達(dá)，呈劑量依賴性(P<0.01)，但正常血清組與模型組比較，Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)以及Bcl-2/Bax 比值無顯著變化(P>0.05)。見圖1，圖2，表1。

A：正常細(xì)胞組；B：H/R模型組；C：正常血清組；D：腦通湯大劑量含藥血清組；E：腦通湯中劑量含藥血清組；F：腦通湯小劑量含藥血清組，下圖同圖1　海馬神經(jīng)元Bcl-2陽性細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(×400)

圖2　海馬神經(jīng)元Bax蛋白陽性細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(×400)

組別Bcl-2BaxBcl-2/Bax正常細(xì)胞組0.45±0.030.17±0.0190.901±0.027H/R模型組0.11±0.011)3)0.42±0.211)3)0.599±0.0381)3)正常血清組0.10±0.000.41±0.0180.563±0.046腦通湯大劑量含藥血清組0.35±0.022)3)0.23±0.0222)3)0.824±0.0102)3)腦通湯中劑量含藥血清組0.29±0.022)0.31±0.0162)0.750±0.0152)腦通湯小劑量含藥血清組0.24±0.022)0.35±0.0902)0.651±0.0182)

與正常細(xì)胞組比較:1)P<0.05；與H/R模型組比較:2)P<0.05，且3)P<0.01；下表同

2.2腦通湯對H/R后海馬神經(jīng)元Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)的影響實時熒光定量PCR顯示：Bcl-2、Bax mRNA的相對表達(dá)量與其蛋白表達(dá)趨勢一致，而Caspase-3 mRNA的相對表達(dá)趨勢與Bax mRNA表達(dá)趨勢一致。見表2。

組別Bcl-2mRNA(2-△△CT)BaxmRNA(2-△△CT)Caspase-3mRNA(2-△△CT)正常細(xì)胞組4.748±1.5890.224±0.0390.187±0.043H/R模型組0.23±0.081)4.58±0.821)5.64±1.401)正常血清組1.096±0.4022)0.958±0.1922)0.838±0.122)腦通湯大劑量含藥血清組3.226±0.6452)3)0.292±0.0412)3)0.323±0.0632)3)腦通湯中劑量含藥血清組2.529±0.6742)0.385±0.0572)0.496±0.0872)腦通湯小劑量含藥血清組2.201±0.6662)0.621±0.1332)0.803±0.1682)

3討論

VD是指由各種缺血性、出血性及急慢性缺血缺氧性腦血管疾病引起的以記憶認(rèn)知功能缺陷為主，伴有語言、情感或人格障礙的一種獲得性智能損害綜合征，其中缺血性腦血管病是VD發(fā)生的主體病因〔7〕。腦缺血再灌注損傷參與并介導(dǎo)缺血性腦血管病的重要病理生理過程，在這個復(fù)雜的病理生理過程中涉及多種機(jī)制及多個環(huán)節(jié)，其中細(xì)胞凋亡是腦缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)之一〔8〕。研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞H/R過程中的病理生理改變類似于體內(nèi)的缺血/再灌注損傷〔9〕。研究證實〔10〕，在局部或全腦缺血引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡中以細(xì)胞凋亡為主。目前發(fā)現(xiàn)，多途徑多因素介導(dǎo)腦缺血再灌注損傷所致神經(jīng)細(xì)胞凋亡，在腦缺血介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡通路中主要是依賴Caspase線粒體介導(dǎo)的凋亡通路和死亡受體介導(dǎo)的凋亡通路。其中Caspases-3 是凋亡過程中最重要的蛋白酶，是多種死亡受體介導(dǎo)凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，被認(rèn)為是凋亡的最終執(zhí)行者〔11〕。已有研究報道，全腦缺血再灌注損傷可誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白及基因Caspase-3表達(dá)的增高，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔12〕。劉麗等〔13〕實驗證實，通過藥物抑制或基因干預(yù)Caspase-3表達(dá)，均可對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生保護(hù)作用。Cheng等〔14〕研究進(jìn)一步證實，Casepase-3也可裂解抗凋亡蛋白Bcl-2，使其失去活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

此外，在參與腦缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中，Bcl-2家族也發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。Bcl-2家族可以分為兩類：一類是以Bcl-2基因為代表的抗細(xì)胞凋亡基因；另一類是以Bax 基因為代表的促細(xì)胞凋亡基因。 細(xì)胞凋亡是一種受基因調(diào)節(jié)的復(fù)雜的自主過程，在這個過程中Bcl-2 與 Bax 雖是同一家族，但其作用卻截然相反，Bcl-2 占優(yōu)勢，保護(hù)細(xì)胞存活，Bax占優(yōu)勢，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，Bax主要通過抑制Bcl-2的功能促進(jìn)凋亡，兩者之間的比例決定著細(xì)胞受到刺激后是凋亡還是存活〔15〕。大量研究證實，通過上調(diào)抗細(xì)胞凋亡基因Bcl-2及Bcl-2/Bax的比值，抑制促細(xì)胞凋亡基因Bax，能顯著減少缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔16〕。

綜上所述在H/R損傷中，以促細(xì)胞凋亡基因及凋亡執(zhí)行基因占主導(dǎo)地位，因而導(dǎo)致海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的趨勢增加。腦通湯能很好地抑制凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)抗細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)，從而發(fā)揮對抗細(xì)胞凋亡的作用，保護(hù)海馬神經(jīng)元。概言之，腦通湯可通過上調(diào)抗細(xì)胞凋亡基因Bcl-2表達(dá)及Bcl-2/Bax比值，抑制促凋亡基因Bax及細(xì)胞凋亡最終執(zhí)行者Caspase-3基因的過度表達(dá)，從而發(fā)揮抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。

參考文獻(xiàn)4

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〔2015-02-17修回〕

(編輯袁左鳴)

The effects of Naotong soup on the expressions of bcl-2,bax,Caspase-3 after hypoxia / reoxygenation in hippocampal of rats

HE Zhu,KUANG Shi-Xiang,ZHANG Shu-Sen，etal.

Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550002，Guizhou，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of Naotong soup on the expressions of bcl-2,bax and Caspase-3 hypoxia/reoxygenation(H/R)in hippocampal of rats.MethodsThe hippocampal neurons cultured for 9 d were randomly divided into normal cell,H/R model,normal serum,large,medium and small doses of Naotong soup medicinal serum groups.The expressions of Bcl-2 and Bax protein of hippocampal neurons were detected by immunohistochemistry.Real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect Bcl-2,Bax and Caspase-3 genes expressions.ResultsCompared with those of normal cell group,the expressions of Bcl-2 protein and Bcl-2/Bax were decreased(P<0.05).However，the expression of Bax protein was significantly increased.Compared with those of model group,the expressions of Bcl-2 protein and Bcl-2/Bax were significantly increased in Naotong soup medicinal serum groups，and Bax protein was decreased too(P<0.05).However,the normal serum group showed no significant change(P>0.05).Bcl-2 and Bax mRNAs trend was consistent with the expression of the protein,and Caspase-3 mRNA trend expression was consistent with Bax mRNA.ConclusionsNaotong soup could suppress H/R neuronal apoptosis through upregulating the expressions of Bcl-2 protein and gene and Bcl-2/Bax，meanwhile，it could inhibit the expressions of Bax and Caspase-3.

【Key words】Naotong soup;Hypoxia/reoxygenation;Hippocampal neurons;Bcl-2;Bax;Caspase-3

通訊作者：況時祥(1962-)，男，教授，碩士，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治老年期癡呆臨床與基礎(chǔ)研究。

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81160490)

中圖分類號〔〕R28〔

文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)24-6973-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.004