姚紹鑫　張貴松　曹宏霞　宋　光　李藏妥　張衛(wèi)濤

(河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院介入科，河北　唐山　063000)

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microRNA-21與大鼠肝癌微環(huán)境中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞表達(dá)的相關(guān)性

姚紹鑫張貴松1曹宏霞宋光李藏妥張衛(wèi)濤

(河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院介入科，河北唐山063000)

摘要〔〕目的研究miRNA(miR)-21與大鼠肝癌微環(huán)境中Treg/Th17比值的相關(guān)性。方法使用二乙基亞硝胺構(gòu)建大鼠肝癌模型，檢測(cè)肝癌大鼠外周血中Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞的含量，并檢測(cè)外周血中miR-21的表達(dá)含量，分析miR-21含量與Treg/Th17比值的相關(guān)性。結(jié)果肝癌大鼠外周血中Th17細(xì)胞占總的CD4+T細(xì)胞含量的5.319%，較對(duì)照組增加；同時(shí)，Treg細(xì)胞占比約為9.472%，較對(duì)照組增加；Treg/Th17的比值在模型組大鼠中為1.781，在正常組中為1.478；miR-21在肝癌大鼠外周血中含量增加，并且與Treg/Th17的比值正相關(guān)。結(jié)論miR-21的表達(dá)水平與Treg/Th17的比值具有正相關(guān)性。

關(guān)鍵詞〔〕肝癌；Th17細(xì)胞；Treg細(xì)胞；miR-21

1灤縣人民醫(yī)院介入科

第一作者：姚紹鑫(1965-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事介入醫(yī)學(xué)研究。

原發(fā)性肝癌發(fā)病機(jī)制與多種因素有關(guān)〔1〕。目前的研究證實(shí)，腫瘤細(xì)胞能夠逃避免疫監(jiān)視，從而引起腫瘤發(fā)生和發(fā)展〔2〕。CD4+T細(xì)胞中的兩個(gè)新亞型即Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞，在多種腫瘤中都發(fā)揮重要的調(diào)控作用〔3〕。近年來，很多研究證實(shí)，microRNA(miR)與肝癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)〔4〕。但是，miR是否與Treg/Th17參與的免疫平衡相關(guān)及具體分子生物學(xué)機(jī)制目前仍不清楚。本研究采用大鼠肝癌模型研究大鼠肝癌微環(huán)境中miR與Treg/Th17細(xì)胞亞群平衡的相關(guān)性。

1材料與方法

1.1大鼠肝癌模型的建立二乙基亞硝胺購自美國Sigma公司。用生理鹽水將二乙基亞硝胺配置成4 mg/ml的溶液，避光保存。購買雄性SD大鼠50只，體重180～220 g，隨機(jī)分為正常組(n=10)及模型組(n=40)。模型組大鼠腹腔注射二乙基亞硝胺(用藥量為20 mg/kg，對(duì)照組給予相同劑量的生理鹽水)，每周給藥3次，持續(xù)給藥12 w。給藥過程中每天觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飲食狀況、精神狀態(tài)、體重變化及被毛變化。第16周抽取靜脈血，麻醉處死，開腹觀察肝臟大體形態(tài)后，取出肝臟，甲醛固定后制備石蠟包埋切片，HE染色后進(jìn)行肝臟病理檢查。

1.2Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞含量的檢測(cè)將細(xì)胞收集到EP管中，2 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌一次，重復(fù)操作離心棄上清，加入熒光標(biāo)記的CD4抗體，避光室溫孵育30 min。再用適量PBS洗滌，2 000 r/min離心5 min，棄上清。再分別對(duì)Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。對(duì)于Th17細(xì)胞，加入Th17破膜劑A液100 μl，避光室溫放置10 min，再加入適量PBS，2 000 r/min離心5 min，棄上清，再加入B液100 μl，隨即加入熒光標(biāo)記的抗IL-17抗體，避光室溫孵育30 min，重復(fù)用PBS洗滌一次，再用適量的PBS重懸細(xì)胞，再轉(zhuǎn)移至流式專用管中，上機(jī)分析；對(duì)于Treg細(xì)胞，加入Foxp3專用破膜劑500 μl，避光4℃孵育30 min，再用專用緩沖液洗滌，2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入5 μl熒光標(biāo)記的抗Foxp3抗體，避光室溫孵育30 min，用PBS洗滌細(xì)胞后重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至流式專用試管內(nèi)，上機(jī)分析。

1.3實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)使用Trizol法抽提分離獲得的PBMC細(xì)胞中的總RNA，所用試劑盒均購自Promega公司。將抽提得到的RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，所用的PCR儀為ABI 7300，所用試劑為TOYOBO公司的SYBR Green。各基因配套引物：IL-17A：正義：5′-TCCCACGAAATCCAGGATGC-3′，反義：5′-GGATGTTCAGGTTGACCATCAC-3′；IL-17F：正義：5′-GCGTTTCCATGTCACGTAACA-3′，反義：5′-CAGCCCAAGTTCCTACACTGG-3′；Foxp3：正義：5′-GTGGCCCGGATGTGAGAAG-3′，反義：5′-GGAGCCCTTGTCGGATGATG-3′。特異性引物購自銳博公司。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS11.0軟件行t或χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1大鼠肝癌模型的建立與評(píng)價(jià)隨給藥時(shí)間延長，與對(duì)照組相比，模型組大鼠精神狀態(tài)明顯變差，飲食狀況下降，體重增長緩慢，反應(yīng)遲緩，被毛雜亂且無光澤。第16周進(jìn)行病理檢查，可見肝細(xì)胞具有核大、染色深等肝癌細(xì)胞典型特征，并呈現(xiàn)明顯的不典型增生，排列呈團(tuán)塊狀或條索狀，并出現(xiàn)向周圍正常肝細(xì)胞的浸潤生長(圖1)。本實(shí)驗(yàn)中，死亡率為7.5%(3/40)，在第16周時(shí)成癌率高達(dá)81.1%(30/37)。

圖1　大鼠肝癌模型第16周肝臟細(xì)胞形態(tài)

2.2大鼠肝癌模型外周血中Treg/Th17的水平30例大鼠肝癌樣本外周血中Th17細(xì)胞(CD4+，IL17+)在所有CD4+T細(xì)胞中的比值為5.319%，對(duì)照組為3.721%，兩組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)；外周血中Treg細(xì)胞(CD4+，F(xiàn)oxp3+)在所有CD4+T細(xì)胞中的比值為9.472%，對(duì)照組為5.498%，兩組之間也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)；Treg/Th17比值在模型組中為1.781，高于正常組1.478(P<0.001)。

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，模型組IL-17A，IL-17F和Foxp3的表達(dá)水平均顯著高于正常組(P<0.05)。

2.3大鼠肝癌模型外周血中miR-21的表達(dá)水平與Treg/Th17比值的關(guān)系模型組外周血中miR-21的含量明顯高于正常組。miR-21的水平與Treg/Th17的比值呈正相關(guān)(R2=0.627 3，P<0.001)。

3討論

Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞屬于CD4+T淋巴細(xì)胞，但不同于Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞。Th17 細(xì)胞可以分泌白介素(IL)-17，能夠在過敏性疾病和自身免疫性疾病發(fā)病中發(fā)揮重要作用。而CD4+CD25+Treg細(xì)胞具有對(duì)抗炎癥和維持自身免疫耐受的作用，進(jìn)而使免疫系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)。Th17 細(xì)胞與Treg細(xì)胞功能上相互抑制，自身免疫性疾病中Th17/Treg失衡，二者的平衡狀態(tài)在維持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)中具有重要的作用〔5，6〕。

在肝癌細(xì)胞中一系列miR出現(xiàn)表達(dá)異常，這些miR的異常表達(dá)可能會(huì)發(fā)揮“癌基因”或“抑癌基因”的功能〔7〕。miR-21是肝癌中研究較多的miR，Hu等〔8〕報(bào)道m(xù)iR-21能夠通過調(diào)控靶基因HEPN1促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖；Wang等〔9〕發(fā)現(xiàn)miR-21的表達(dá)水平能夠預(yù)測(cè)肝癌的預(yù)后；Bao等〔10〕發(fā)現(xiàn)miR-21能夠抑制靶基因PTEN和hSulf-1的表達(dá)，從而通過AKT/ERK信號(hào)通路促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。但是，miR-21是否與腫瘤微環(huán)境中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞失衡相關(guān)目前仍不清楚。

miR是否參與腫瘤微環(huán)境中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的平衡失調(diào)目前研究較少，Lv等〔11〕報(bào)道m(xù)iR141-CXCL1-CXCR2信號(hào)誘導(dǎo)的Treg招募能夠調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移和存活率；Dong等〔12〕報(bào)道在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中，miR-21表達(dá)降低與Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例的失衡具有相關(guān)性。盡管本研究中miR-21表達(dá)上調(diào)與Th17/Treg比例正相關(guān)，但還需要研究其具體的分子生物學(xué)調(diào)控機(jī)制，為疾病的診斷和治療提供新靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)4

1Nault JC，Villanueva A.Intratumor molecular and phenotypic diversity in hepatocellular carcinoma〔J〕.Clin Cancer Res，2015;21(8):1786-8.

2Martinez-Bosch N，Navarro P.Targeting Galectin-1 in pancreatic cancer：immune surveillance on guard〔J〕.Oncoimmunology,2014;3(8)：e952201.

3Nguyen AH，Berim IG，Agrawal DK.Cellular and molecular immunology of lung cancer：therapeutic implications〔J〕.Expert Rev Clin Immunol，2014；10(12)：1711-30.

4Gong J，He XX，Tian A.Emerging role of microRNA in hepatocellular carcinoma(Review)〔J〕.Oncol Lett，2015；9(3)：1027-33.

5Thakur C，Wolfarth M，Sun J，etal.Oncoprotein mdig contributes to silica-induced pulmonary fibrosis by altering balance between Th17 and Treg T cells〔J〕.Oncotarget，2015;6(6):3722-36.

6Talaat RM，Mohamed SF，Bassyouni IH，etal.Th1/Th2/Th17/Treg cytokine imbalance in systemic lupus erythematosus(SLE)patients：correlation with disease activity〔J〕.Cytokine,2015;72(1)：146-53.

7Chang-Hao Tsao S，Behren A，Cebon J，etal.The role of circulating microRNA in hepatocellular carcinoma〔J〕.Front Biosci(Landmark Ed),2015;20(1)：78-104.

8Hu S，Tao R，Wang S，etal.MicroRNA-21 promotes cell proliferation in human hepatocellular carcinoma partly by targeting HEPN1〔J〕.Tumour Biol,2015;〔Epub ahead of print〕.

9Wang WY，Zhang HF，Wang L，etal.miR-21 expression predicts prognosis in hepatocellular carcinoma〔J〕.Clin Res Hepatol Gastroenterol,2014;38(6)：715-9.

10Bao L，Yan Y，Xu C，etal.MicroRNA-21 suppresses PTEN and hSulf-1 expression and promotes hepatocellular carcinoma progression through AKT/ERK pathways〔J〕.Cancer Lett,2013;337(2)：226-36.

11Lv M，Xu Y，Tang R，etal.miR141-CXCL1-CXCR2 signaling-induced Treg recruitment regulates metastases and survival of non-small cell lung cancer〔J〕.Mol Cancer Ther,2014;13：3152-62.

12Dong L，Wang X，Tan J，etal.Decreased expression of microRNA-21 correlates with the imbalance of Th17 and Treg cells in patients with rheumatoid arthritis〔J〕.J Cell Mol Med,2014;18：2213-24.

〔2015-08-20修回〕

(編輯李相軍)

The correlation between microRNA-21 and Treg/Th17 ratio in the microenvironment of rats with hepatocellular carcinoma

YAO Shao-Xin,ZHANG Gui-Song,CAO Hong-Xia,etal.

Tangshan Hospital Affiliated Hebei Medical University,Tangshan 063000,Hebei,China

【Abstract】ObjectiveTo study the correlation between microRNA(miR)-21 and Treg/Th17 ratio in the microenvironment of rats with hepatocellular carcinoma.MethodsDiethylnitrosamine was used to build the hepatocellular carcinoma model of rats;the Treg cells and Th17 cells contents in peripheral blood were detected;and the expression of miR-21 was also detected,the correlation analysis between miR-21 expression and Treg / Th17ration was analyzed.ResultsTh17 cells content in peripheral blood in total CD4 +T-cell was about 5.319%,which was more than that of control group;while Treg cells content was about 9.472%,which was also more than that of control group;Treg/Th17 ratio in model group was 1.781,compared with 1.478 in normal group;miR-21 expression was increased in the peripheral blood of hepatocellular carcinoma in rats,and showed a positive correlation with the ratio of Treg/Th17.ConclusionsThere is a positive correlation between the expression level of miR-21 and the ratio of Treg/Th17.

【Key words】Hepatocellular carcinoma;Th17 cells;Treg cells;microRNA-21

通訊作者：宋光(1982-)，男，主治醫(yī)師，主要從事介入醫(yī)學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：國家十二五科技支撐計(jì)劃(2012BAI15B06)

中圖分類號(hào)〔〕R735〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)24-6971-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.003