李榮雙　范淑玲　李立平

(內蒙古阿榮旗中蒙醫(yī)院,內蒙古　阿榮旗　162750)

?

真核細胞翻譯延伸因子2參與神經(jīng)生長因子誘導的大鼠嗜鉻細胞瘤細胞的分化

李榮雙范淑玲1李立平2

(內蒙古阿榮旗中蒙醫(yī)院,內蒙古阿榮旗162750)

摘要〔〕目的研究神經(jīng)生長因子(NGF)誘導大鼠嗜鉻細胞瘤細胞系PC12細胞分化途徑中，細胞突觸生長的起始和延伸步驟中的關鍵蛋白質，尋找其中可能的藥物靶點。方法50 ng/ml NGF誘導PC12細胞6 h和12 h，顯微鏡下觀察PC12細胞的形態(tài)變化；應用二維凝膠電泳、DeCyder軟件分析及基質輔助激光解析/電離-飛行時間質譜，研究其差異蛋白質組學變化。結果NGF作用于PC12細胞6 h后，細胞出現(xiàn)神經(jīng)突起；12 h，神經(jīng)突起進一步生長，蛋白質分析提示真核細胞翻譯延伸因子(eEF)2含量減少，α微管蛋白和β肌動蛋白表達增加。結論NGF誘導PC12細胞發(fā)生神經(jīng)突觸生長，eEF-2的減少與細胞骨架蛋白增加與細胞的形態(tài)學變化一致，提示突觸生長過程中，eEF-2可能起到關鍵性作用。

關鍵詞〔〕大鼠嗜鉻細胞瘤細胞系細胞；神經(jīng)生長因子；神經(jīng)分化

1北京沙河95820部隊衛(wèi)生隊2北京沙河95906部隊航醫(yī)室

第一作者：李榮雙(1972-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事心血管疾病研究。

神經(jīng)生長因子(NGF)是最早被發(fā)現(xiàn)和純化的多肽生長因子，是神經(jīng)營養(yǎng)因子(NT)家族的典型代表。NGF可促進神經(jīng)元的生長及增進其分化〔1〕，并且能夠引導神經(jīng)生長錐的移動，決定神經(jīng)軸突延伸方向〔2〕。因此，NGF具有巨大的治療神經(jīng)損傷疾病的潛力〔3〕。深入了解NGF對神經(jīng)細胞作用的機制，發(fā)現(xiàn)其信號轉導通路中的成員，可以為NGF的臨床應用提供思路和方向〔4〕。本研究應用NGF對PC12細胞分化進行誘導，進行蛋白質組學研究，以探索神經(jīng)細胞形態(tài)學變化的分子生物學機制。

1材料與方法

1.1試劑與儀器PC12細胞購買自中國科學院的上海細胞庫，DMEM購買自Gibco公司，神經(jīng)生長因子購買自廈門北大之路生物工程有限公司。CyDye熒光標記物(包括Cy2、Cy3及Cy5)、二甲基甲酰胺、甘油、十二烷基磺酸鈉、甘氨酸、瓊脂糖、蛋白酶抑制劑和蛋白質組學耗材購買自GE Healthcare-Biosciences公司。

1.2NGF誘導PC12細胞分化PC12細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為37℃，CO2濃度為5%。細胞接種密度為2×105/ml，培養(yǎng)1 d。細胞貼壁之后，加入終濃度50 ng/ml的NGF，對照組中加入培養(yǎng)液，6 h和12 h后進行吖啶橙(AO)和溴化乙啶(EB)(100 μg/mL)染色，觀察細胞形態(tài)變化。

1.3蛋白質組學分析留取4組不同代數(shù)的細胞，按上述方法處理后，獲得對照組及實驗組細胞。4℃下，500 r/min離心5 min后，進行細胞裂解。室溫下，25 000 r/min再次離心30 min，吸取上清。蛋白質定量試劑盒測定蛋白濃度，每個樣品取50 μg蛋白，按實驗操作規(guī)范，避光冰浴標記相應樣品30 min。標記好的蛋白質樣品進行混合后，上樣至膠槽中，放置固相pH梯度干膠條，置于Ettan IPGphor Ⅱ電泳儀上，經(jīng)過水化與等電聚焦，膠條轉移至SDS-PAGE膠上端，進行常規(guī)電泳。激光掃描儀掃描后，專用軟件進行分析，找到差異蛋白質點。

1.4鑒定差異蛋白質取實驗組和對照組蛋白質，制作制備膠，考染。切膠儀切取相應的差異蛋白質點，37℃下20 ng/μl胰蛋白酶作用2 h。點樣后，測定肽質量指紋譜數(shù)據(jù),NCBI蛋白質數(shù)據(jù)庫檢索。

2結果

2.1NGF誘導PC12細胞分化配制好的50 ng/ml NGF加入PC12細胞中，作用6 h，經(jīng)AO和EB的雙重染色，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：未分化PC12細胞為散在生長或者聚團生長的圓形(圖1A)；NGF加入后，PC12細胞發(fā)生了形態(tài)學改變，胞體開始出現(xiàn)突起(圖1B)；隨著NGF作用時間延長，細胞的突起進一步延長，開始的向神經(jīng)細胞分化，部分突起連接成網(wǎng)絡(圖1C)。

圖1　NGF處理后PC12細胞的形態(tài)改變(×200)

2.2NGF誘導的PC12細胞分化后的蛋白質組學研究PC12細胞經(jīng)過NGF作用后，經(jīng)細胞蛋白提取，應用電泳進行分離，二維電泳膠圖見圖2；DeCyder軟件分析PC12細胞的蛋白質組變化；基質輔助激光解析/電離-飛行時間質譜儀成功鑒定了3個差異表達蛋白：真核細胞翻譯延伸因子(eEF)-2、α微管蛋白和β肌動蛋白。NGF作用后，前者的表達量減少，作用后6 h和12 h分別為對照組的82%(P<0.01)和71%(P<0.01)，其中α微管蛋白增加至對照組的129%(P<0.01)和131%，而β肌動蛋白增加至對照組的125%(P<0.01)和140%。圖3為α-微管蛋白的肽質量指紋圖譜，橫軸為質核比(m/z)，y軸為相對豐度。

圖2　質譜鑒定的PC12細胞分化后的差異表達蛋白

3討論

2000年，人類基因組序列測定的完成，標志著后基因組時代的到來。但從基因到蛋白質存在著轉錄、翻譯及翻譯后修飾等多個水平的調控機制，基因產(chǎn)物是否及何時被破譯、基因產(chǎn)物的表達量、蛋白的相互作用等多種信息都無法從基因水平進行判斷。因此，要精確闡明生命的生理及病理機制，只有將功能基因組學與蛋白質組學相結合〔5〕。蛋白質組學采用蛋白質分離手段結合蛋白質的鑒定技術，全景式地研究在某一特定環(huán)境下細胞或組織的全部蛋白質。它能夠高通量、高分辨率地研究蛋白質，能夠為探討疾病的發(fā)病機制、新藥開發(fā)提供理論基礎〔6,7〕。

NGF是到目前為止最有潛力應用于神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病治療的藥物之一，探究其對神經(jīng)細胞的作用機制，有助于對該藥物的臨床應用進行指導，尋找藥物治療的靶點。本研究將NGF應用于PC12細胞，誘導細胞突觸生長，進行差異蛋白質組學研究，鑒別3種差異表達蛋白質，分別為表達減少的eEF-2、表達增加的α微管蛋白和β肌動蛋白。

eEF-2是一種延伸因子，在蛋白質合成中占據(jù)重要的位置，通過催化核糖體沿mRNA遷移而推動和控制蛋白質合成〔8〕，eEF-2激酶催化完成此過程。NGF作用于PC12細胞后，eEF-2激酶的活性被很快降低〔9〕。有報道證實，胃腫瘤細胞敲除eEF2后，細胞停滯于G2/M期〔10〕。本實驗檢測到NGF作用6 h后，PC12細胞的eEF-2表達明顯減少，而作用12 h后，該蛋白表達進一步減少。其原因是，NGF處理前，PC12細胞處于增殖狀態(tài)，而NGF處理后，PC12細胞開始了分化途徑，蛋白質的組成和數(shù)量發(fā)生改變，在此過程中eEF-2可能發(fā)揮著細胞蛋白質合成的重要作用，與細胞出現(xiàn)神經(jīng)突起的形態(tài)學變化一致。

微管(MT)、微絲(MF)和中間絲(IF)組成了神經(jīng)元的細胞骨架。α和β微管蛋白兩個亞單位構成了微管，細胞內的囊泡、細胞器和蛋白質的交通運輸依賴微管。肌動蛋白是微絲的基本構成單位，而中間絲則是由多種不同來源的纖維狀蛋白組成。上述多個蛋白聚合所構成的彼此連接的網(wǎng)絡，共同參與維持神經(jīng)元的形態(tài)和功能〔11〕。NGF作用于PC12細胞之后，細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細胞突起明顯增多延伸，向神經(jīng)細胞的方向發(fā)展。伴隨此形態(tài)變化，細胞的蛋白質構成發(fā)生了變化，除eEF-2表達減少外，細胞骨架蛋白中的α微管蛋白和β肌動蛋白明顯增加，與細胞的形態(tài)學變化一致，進一步證實了NGF的誘導PC12細胞分化的作用。

參考文獻4

1Boyce VS,Mendell LM.Neurotrophins and spinal circuit function〔J〕.Front Neural Circuits,2014；8:59.

2Muller WA.發(fā)育生物學〔M〕.黃秀英,勞為德,鄭瑞珍,譯.北京:高等教育出版社,方普林格出版社,1998：184-94.

3Zhang H,Wu F,Kong X,etal.Nerve growth factor improves functional recovery by inhibiting endoplasmic reticulum stress-induced neuronal apoptosis in rats with spinal cord injury〔J〕.J Transl Med,2014；12:130.

4Terda K,Kojima Y,Watanabe T,etal.Inhibition of nerve growth factor- induced neurite outgrowth from PC12 cells by dexamethasone:signaling pathways through the gulcocorticoid receptor and phosphorylated Akt and ERK1/2 〔J〕.PLoS One,2014；9:e93223.

5Wu X,Hasan MA,Chen JY.Pathway and network analysis in proteomics〔J〕.J Theor Biol,2014；362:44-52.

6Beretov J,Wasomg ER VC,Graham PH,etal.Proteomics for breast cancer urine biomarkers〔J〕.Adv Clin Chem,2014；63:123-67.

7Pelaia G,Terracciano R,Vatrella A,etal.Application of proteomics and peptidomics to COPD〔J〕.Biomed Res Int,2014；2014:764581.

8Heise C,Gardoni F,Culotta L.Elongation factor-2 phosphorylation in dendrites and the regulation of dendritic mRNA translation in neurons〔J〕.Front Cell Neurosci,2014；8(1):35.

9Nairn AC,Nichols RA,Brady MJ,etal.Nerve growth factor treatment or cAMP elevation reduces Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅲ activity in PC12 cells〔J〕.J Biol Chem,1987；262:14265-72.

10Nakamura J,Aoyagi S,Nanchi I,etal.Overexpression of eukaryotic elongation factor eEF2 in gastrointestinal cancers and its involvement in G2/M progression in the cell cycle〔J〕.Int J Oncol,2009；34:1181-9.

11Lariviere RC,Julien JP.Functions of intermediate filaments in neuronal development and disease〔J〕.J Neurobiol,2004；58:131-148.

〔2014-10-29修回〕

(編輯曲莉)

中圖分類號〔〕Q503〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6720-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.033