王燕嬉

(白城醫(yī)學高等?？茖W校，吉林　白城　137000)

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免疫組化染色及熒光原位雜交法檢測肺鱗狀細胞癌中間變性淋巴瘤激酶基因蛋白的表達

王燕嬉

(白城醫(yī)學高等?？茖W校，吉林白城137000)

摘要〔〕目的采用免疫組化染色及熒光原位雜交法檢測肺鱗狀細胞癌中間變性淋巴瘤激酶基因(ALK)蛋白的表達情況。方法收集診斷為肺鱗狀細胞癌未經任何篩選的石蠟固體標本194例，采用高特異性和敏感性的抗ALK抗體(D5F3)進行免疫組化染色檢測，并對檢測中呈陽性的標本進一步進行熒光原位雜交檢測。結果免疫組化法共檢出ALK呈強陽性的標本3例(1.55%)；中等強度的標本3例(1.55%)；弱陽性標本5例(2.58%)；進一步行熒光原位雜交檢測顯示，僅ALK呈強陽性的標本中存在有棘皮類微管蛋白4(EML-4)-ALK基因融合，而免疫組化染色檢測中呈中等強度和弱陽性標本為假陽性。結論EML4-ALK基因融合在肺鱗狀細胞癌中少量存在，對于克唑替尼靶向治療是否有敏感性仍需要進一步臨床研究；免疫組化染色檢測ALK蛋白顯示為強陽性才可確診為存在EML4-ALK基因融合。

關鍵詞〔〕肺鱗狀細胞癌；ALK；熒光原位雜交

第一作者：王燕嬉(1974-)，女，碩士，副教授，主要從事免疫組化研究。

目前肺癌的治療有效率仍很低，治療預后極差。近年來靶向治療藥物的出現(xiàn)給非小細胞肺癌(NSCLC)患者的治療提供了新的思路。對表皮生長因子受體(EGFR)突變的酪氨酸激酶小分子抑制劑具有特異性的靶向治療藥物，已逐漸成為臨床治療攜帶EGFR突變癌癥患者的一線藥物，并取得了較好的療效。隨著NSCLC中棘皮類微管蛋白4(EML-4)和間變性淋巴瘤激酶基因(ALK)融合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)〔1〕，研發(fā)出了新的靶向治療藥物克唑替尼。相關研究顯示，EML4-ALK融合基因在NSCLC患中的發(fā)生率約為2%～8%〔2〕。目前，國內外多針對肺腺癌患者利用克唑替尼進行靶向治療的相關問題進行研究，涉及到肺鱗狀細胞癌的研究報道很少。本研究旨在為臨床對于采用高特異性和敏感性的抗ALK抗體進行檢測的患者靶向治療的開展提供參考。

1材料與方法

1.1材料收集診斷為肺鱗狀細胞癌未經任何篩選的石蠟固體標本194例，其中手術切除標本139例，活檢55例；男165例，女29例；年齡52～90歲，平均(61.03±10.64)歲。以上患者均經p63、CK5/6、TTF-1免疫組化染色確診為肺鱗狀細胞癌，見圖1。

圖1　肺鱗狀細胞癌

1.2免疫組化法檢測收集到的標本均采用10%的中性甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片厚4～5 μm。ALK蛋白采用免疫組化法檢測，采用美國VENTANA 公司的ALK(D5F3)兔單克隆抗體。操作嚴格按照試劑盒說明書進行，每次染色時均設置陰性和陽性對照。免疫組化法采用EnVision兩步法進行染色。

1.3熒光原位雜交檢測選用廣州深達生物制品技術有限公司的ALK雙色分離探針試劑盒，探針獨立位于2號染色體短臂末端(2p23)區(qū)域。具體操作：連續(xù)切片厚4 μm，烤片、胃蛋白酶消化后，在室溫條件下采用2×SSC漂洗2次，10 min/次。加入探針10 μl，78℃條件下變性后于42℃溫度下雜交。洗滌后置于熒光顯微鏡下觀察。

2結果

2.1免疫組化檢測結果共檢出ALK呈強陽性的標本3例；中等強度的標本3例；弱陽性標本5例見圖2。

圖2　免疫組化染色檢測結果

A：無EML4-ALK融合基因，細胞核中存在兩個黃色信號；B：存在融合基因，細胞核中分別有一個黃色信號、一個紅色信號、一個綠色信號，存在信號分離；C和D：細胞信號部分存在丟失現(xiàn)象，若細胞核中存在紅色信號和黃色信號，仍可判斷為存在融合基因圖3　熒光原位雜交檢測EML4-ALK融合基因

2.2熒光原位雜交檢測結果為確認免疫組化染色檢測結果的準確性，對呈陽性的11例標本進一步行熒光原位雜交檢測。免疫組化染色檢測呈強陽性的標本中，熒光原位雜交檢測顯示存在有分離信號；免疫組化染色檢測呈中度或弱陽性的標本中，未檢測到EML4-ALK基因融合，見圖3。

3討論

研究已證實EML4-ALK融合基因為肺腺癌、NSCLC的激活基因，在NSCLC中該基因重排的發(fā)生率約為4%～5%〔3〕。雖然多數(shù)對NSCLC的研究中包括肺鱗狀細胞癌，但該類癌癥的研究樣本量普遍偏少，已公開報道的研究重點多集中于肺腺癌。僅國外有少量關于肺鱗狀細胞癌中EML4-ALK融合基因的研究報道。Yamane等〔4〕研究報道了1例確診為攜帶有該融合基因的肺鱗狀細胞癌的43歲的女性患者；Popat等〔5〕研究報道了1例70歲男性攜帶該融合基因的肺鱗狀細胞癌患者；Nottegar等〔6〕對53例英國肺鱗狀細胞癌患者的EML4-ALK融合基因情況進行研究顯示，其中1例存在有該融合基因，占1.89%。我國目前尚未見對肺鱗狀細胞癌中ALK的相關研究報道。

本研究中國內肺鱗狀細胞癌患者中ALK融合基因的比例與國外研究〔6〕報道的1.89%之間無明顯差異，同時本研究中具有較大的樣本量，得到的結論更可信。攜帶ALK基因融合的肺鱗狀細胞癌中關于靶向治療藥物XALKORI膠囊的具體反應仍需進一步深入研究，本次研究可為我國居民中肺鱗狀細胞癌患者的靶向治療提供理論參考。

目前，隨著醫(yī)療技術的發(fā)展，我國大型醫(yī)院大部分已經具備了通過免疫組化法檢測NSCLC EML4-ALK融合基因的能力；但采用熒光原位雜交技術檢測ALK融合基因仍未得到推廣。同時在實際操作中，判斷ALK陽性表達標準的準確率仍較低，確診有一定的困難。本研究僅有免疫組化法檢測結果ALK呈強陽性的標本中才存在有EML4-ALK融合基因，可為臨床病理醫(yī)師的日常工作提供參考。

參考文獻4

1Soda M,Choi YL,Enomoto M,etal.Identification of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer〔J〕.Nature,2007;448(7153):561-6.

2Antoniu SA.Crizotinib for EML4-ALK positive lung adenocarcinoma:a hope for the advanced disease? Anaplastic lymphoma kinase inhibition in non-small-cell lung cancer〔J〕.N Engl J Med,2010;363(18):1693-703.

3陳佳艷.EML4-ALK融合基因與非小細胞肺癌〔J〕.中國癌癥雜志,2010;20(6):474-8.

4Yamane H,Ochi N,Yamagishi T,etal.Can we eliminate squamous cell carcinoma of the lung from testing of EML4-ALK fusion gene〔J〕?Lung Cancer,2013;79(1):94-5.

5Popat S,Alrifai D,Ahmed M,etal.A rare case of squamous cell carcinoma of the lung harbouring ALK and BRAF activating mutations〔J〕.Lung Cancer,2013;80(3):339-40.

6Nottegar A,Calio A,Gilioli E,etal.ALK/EML4 fusion gene may be found in pure squamous carcinoma of the lung〔J〕.J Thorac Oncol,2014;9(5):729-32.

〔2015-01-09修回〕

(編輯李相軍/滕欣航)

基金項目：吉林省教育廳“十二五”規(guī)劃項目(20140128)

中圖分類號〔〕R73〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6718-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.032