鄧　娟　王延江　劉　娟　易　旭　曾　凡　劉雨輝　姚秀卿　曹洪元　嚴(yán)家川　周華東　許志強(qiáng)

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所神經(jīng)內(nèi)科，重慶　400042)

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α7nAchR 713T>C突變對(duì)阿爾茨海默病小鼠認(rèn)知功能和tau蛋白磷酸化的影響

鄧娟王延江劉娟易旭曾凡劉雨輝姚秀卿曹洪元嚴(yán)家川周華東許志強(qiáng)

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所神經(jīng)內(nèi)科，重慶400042)

摘要〔〕目的研究α7nAchR 713T>C突變對(duì)阿爾茨海默病(AD)小鼠認(rèn)知功能和tau蛋白磷酸化的影響。方法3月齡敲除α7nAchR基因的APPSwe小鼠(APPa7KO小鼠)20只，隨機(jī)分為2組，每組10只，分別在AD小鼠海馬注射突變型和野生型7nAchR cDNA，注射后采用Morris水迷宮檢測(cè)APPa7KO小鼠認(rèn)知功能的變化，免疫組化方法檢測(cè)AD小鼠tau(Thr231)表達(dá)。結(jié)果與注射野生型7nAchR cDNA小鼠相比，注射突變型7nAchR cDNA小鼠的逃避潛伏期和游泳距離延長(zhǎng)，小鼠海馬tau(Thr231)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增多(P<0.01)。結(jié)論α7nAchR 713T>C突變加重了AD小鼠的認(rèn)知功能損害和tau蛋白磷酸化。

關(guān)鍵詞〔〕α7nAchR；阿爾茨海默病；tau蛋白

第一作者：鄧娟(1976-)，女，副主任醫(yī)師，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事老年性癡呆發(fā)生機(jī)制與防治研究。

阿爾茨海默病(AD)是影響老年人健康的一個(gè)重要疾病，揭示AD發(fā)病機(jī)制、尋找有效防治方法是急需解決的重要科學(xué)問(wèn)題〔1〕。研究表明，吸煙增加了AD發(fā)生的危險(xiǎn)性和病情嚴(yán)重程度，但具體機(jī)制尚不清楚〔2～4〕。尼古丁是香煙中的主要致病物質(zhì)，7煙堿型乙酰膽堿受體(7nAChR)介導(dǎo)了尼古丁的神經(jīng)毒性作用〔5〕。前期研究表明，在漢族老年人群中吸煙使AD發(fā)生的危險(xiǎn)性提高2.72倍。在吸煙患AD的人群中7nAChR基因第7外顯子Leu238Pro(713T>C)突變頻率明顯高于吸煙未患AD的人群〔6〕，提示7nAChR基因該位點(diǎn)突變可能參與了吸煙人群AD的發(fā)生過(guò)程。本研究探討7nAChR 713T>C突變對(duì)AD認(rèn)知功能和tau蛋白磷酸化的影響。

1材料與方法

1.1材料與試劑3月齡APPa7KO小鼠20只，均源于美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室。tau(Thr231)，tau(pT181) 和 tau(ps202)抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signal公司，突變型AAV-7nAchR cDNA，野生型AAV-7nAchR cDNA自行構(gòu)建。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組APPa7KO小鼠20只，隨機(jī)分為突變型和野生型，每組10只，分別在小鼠海馬注射突變型7nAchR cDNA和野生型7nAchR cDNA。

1.2.2海馬注射采用吸入麻醉機(jī)下 Halothane 麻醉小鼠，將小鼠固定于立體注射儀上。頭頂剃毛消毒后，切開(kāi)頭頂皮膚，暴露顱骨。海馬注射定位：在左側(cè)囟門(mén)后2.3 mm，中線外側(cè)1.8 mm處鉆孔。采用Hamilton微量注射器，從鉆孔出垂直進(jìn)針2.0 mm。以0.5 μl/min的速度于左側(cè)注入2 μg突變型AAV-7nAchR cDNA或野生型AAV-7nAchR cDNA，注射完畢后留針2 min，以0.5 mm/30 s的速度退針。

1.2.3AD小鼠行為學(xué)檢測(cè)Morris水迷宮進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。水池分為4個(gè)象限，分別稱(chēng)SW、NW、SE、NE象限，在NE象限正中放置一直徑6 cm的平臺(tái)，平臺(tái)頂?shù)陀谒?.5 cm。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)光線良好，水溫維持在(25±0.5)℃，攝像機(jī)安置于水池上方2.5 m處，并與安裝有示蹤軟件的計(jì)算機(jī)相連。①定位航行實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前1 d下午將小鼠放入水中自由游泳2 min，使其熟悉實(shí)驗(yàn)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)歷時(shí)4 d，每天上、下午2個(gè)時(shí)間段，每個(gè)時(shí)間段訓(xùn)練4次。每次訓(xùn)練隨機(jī)選擇一個(gè)入水點(diǎn)將小鼠面向池壁放入水池，記錄小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間，即逃逸潛伏期。至90 s找不到平臺(tái)，即將其引上平臺(tái)，潛伏期記為90 s。每一時(shí)間段內(nèi)4次潛伏期的算術(shù)平均值作為這一時(shí)間段的學(xué)習(xí)成績(jī)；②空間探索實(shí)驗(yàn)：訓(xùn)練第4天平臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠在籠中停留2 h。然后撤除平臺(tái)，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。將小鼠放至池中，記錄實(shí)驗(yàn)小鼠在40 s內(nèi)穿越平臺(tái)所在象限的次數(shù)，計(jì)算小鼠在平臺(tái)所在象限的游泳時(shí)間占總時(shí)間的百分比。

1.2.4免疫組化染色行為學(xué)檢測(cè)完畢后后次日殺死動(dòng)物并灌注、取材，行冠狀冰凍切片，片厚25 μm，每隔6張取1張切片，取其中1套(約10張含海馬結(jié)構(gòu))進(jìn)行免疫組化染色并計(jì)數(shù)，累加后乘6即為一側(cè)海馬tau(Thr231)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。新鮮配置3%H2O2，室溫浸泡5～10 min以滅活內(nèi)源性酶；PBS洗滌10 min×3次，加封閉用血清，室溫30 min。滴加tau(Thr231)一抗(1∶500)，恒溫下(4℃)孵育24 h；PBS沖洗10 min×3次，加入封閉緩沖液配制的二抗為抗兔IgG生物素標(biāo)記二抗溶液(1∶500)，室溫孵育2 h。PBS沖洗10 min×3次，加入ABC(1∶200)，室溫孵育1 h。DAB顯色，鏡下觀察并及時(shí)終止顯色。梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片陰干后鏡下觀察。

2結(jié)果

2.1Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)兩組小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間隨著訓(xùn)練天數(shù)縮短，突變型7nAchR AD小鼠在每個(gè)時(shí)間段平均逃避潛伏期大于野生型7nAchR AD小鼠(P<0.05)。見(jiàn)表1。兩組小鼠游泳速度隨著訓(xùn)練天數(shù)增加而減慢，但兩組間的游泳速度無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。空間探索試驗(yàn)中，兩組小鼠多圍繞池壁游泳或跨直徑游泳。突變型7nAchR AD小鼠初次找到平臺(tái)的時(shí)間〔(16.39±6.52)s〕多于野生型7nAchR AD小鼠〔(11.28±5.74)s〕，跨越平臺(tái)的次數(shù)〔(2.20±1.00)次〕少于野生型7nAchR AD小鼠〔(4.20±0.8)次，P<0.05〕。

組別1d2d3d4d突變型29.25±6.971)21.58±3.671)17.63±3.251)14.41±2.131)野生型24.13±4.5516.76±3.1913.41±2.5610.35±1.34

與野生型比較：1)P<0.05

組別1d2d3d4d突變型15.92±0.9711.47±0.5910.53±0.549.48±0.47野生型15.23±0.9111.62±0.6210.69±0.4810.03±0.42

2.2AD小鼠tau(Thr231)的表達(dá)突變型7nAchR AD小鼠海馬平均tau(Thr231)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(236.35±34.68)與野生型AD小鼠(128.62±16.35)比較明顯增多(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1　免疫組化檢測(cè)AD小鼠海馬tau(Thr231)陽(yáng)性細(xì)胞(DAB，×200)

3討論

tau蛋白異常磷酸化是AD的重要特征，研究發(fā)現(xiàn)α7nAChR與tau蛋白異常磷酸化存在密切關(guān)系，在AD的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用〔7，8〕。α7nAchR同時(shí)也介導(dǎo)了tau蛋白異常磷酸化，尼古丁與α7nAchR結(jié)合后，通過(guò)p38途徑引起tau蛋白在ser202、thr181、thr231等位點(diǎn)的異常磷酸化〔9，10〕。α7nAChR在促進(jìn)tau蛋白磷酸化中發(fā)揮重要的作用。

為闡明α7nAchR Leu238Pro(713T>C)突變?cè)贏D發(fā)生中的作用，本研究克隆了此含有該突變的突變型人α7nAchR基因和野生型人α7nAchR基因。以腺相關(guān)病毒為載體，在α7nAchR基因敲除的APPSwe小鼠腦內(nèi)轉(zhuǎn)染突變型和野生型人α7nAchR基因，檢測(cè)α7nAchR713T>C突變對(duì)AD小鼠的影響，結(jié)果顯示α7nAchR 713T>C突變加重了AD小鼠的認(rèn)知功能損害和tau蛋白磷酸化。

α7nAchR M1-M2區(qū)是決定受體功能的關(guān)鍵位點(diǎn)〔11，12〕，我們發(fā)現(xiàn)的α7nAChR 713T>C突變恰好位于該區(qū)域。該區(qū)域的氨基酸序列非常保守，此突變可能對(duì)受體的表達(dá)和功能產(chǎn)生重要影響〔13，14〕。α7nAchR Leu238Pro(713T>C)的突變加重了AD小鼠的認(rèn)知功能損害和tau蛋白異常磷酸化，可能與α7nAchR 713T>C突變影響7nAChR與配體的結(jié)合能力有關(guān)。7nAChR與尼古丁結(jié)合后能抑制Aβ的神經(jīng)毒性作用而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，7nAChR M1-M2區(qū)是決定受體功能的關(guān)鍵位點(diǎn)。該突變可能影響7nAChR與配體的結(jié)合能力，或由于突變導(dǎo)致受體空間構(gòu)象改變影響離子通道開(kāi)放，從而使其喪失神經(jīng)保護(hù)作用。腦內(nèi)tau蛋白異常磷酸化是AD的重要特征。而7nAChR的選擇性配體或激動(dòng)劑可抑制tau蛋白磷酸化。推測(cè)7nAchR發(fā)生713T>C突變后，可能失去其抑制功能，而導(dǎo)致tau蛋白異常磷酸化加劇。

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〔2014-06-05修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)

通訊作者：許志強(qiáng)(1969-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事老年性癡呆的研究。

基金項(xiàng)目：第三軍醫(yī)大學(xué)青年人才創(chuàng)新基金(No.2010XQN31)

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R749〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)23-6716-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.031