王志學(xué)　張曉俠　雷　燕　劉新偉　李汝泓

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，河北　承德　067000)

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芬太尼與5-氟尿嘧啶聯(lián)合誘導(dǎo)MCF-7乳腺癌細(xì)胞凋亡及其機(jī)制

王志學(xué)張曉俠雷燕1劉新偉李汝泓

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，河北承德067000)

摘要〔〕目的研究芬太尼與5-氟尿嘧啶(FU)聯(lián)合應(yīng)用對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響及內(nèi)、外源性途徑的調(diào)控機(jī)制。方法作用48 h后通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)檢測(cè)Annexin V-EGFP/PI染色的細(xì)胞凋亡情況，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)Bcl-2、Bax、Fas表達(dá)情況。結(jié)果單獨(dú)應(yīng)用芬太尼時(shí)1 μmol/L與10 μmol/L濃度組凋亡率均增加(P<0.05，P<0.01)，Bcl-2表達(dá)減弱(P<0.05，P<0.01)、Bax表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01)、Fas表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01)；單獨(dú)應(yīng)用500 μmol/L 5-FU后凋亡率亦明顯增加(P<0.01)，Bcl-2表達(dá)減弱(P<0.01)、Bax、Fas表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01)；聯(lián)合應(yīng)用芬太尼與5-FU，協(xié)同作用在3組均顯現(xiàn)(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論芬太尼、5-FU在一定濃度范圍內(nèi)單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用可促進(jìn)MCF-7乳腺癌細(xì)胞凋亡，并使Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax、Fas表達(dá)上調(diào)。聯(lián)合應(yīng)用兩類(lèi)藥物可能在內(nèi)源性、外源性途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡上顯示協(xié)同效應(yīng)。

關(guān)鍵詞〔〕芬太尼；5-氟尿嘧啶；MCF-7；凋亡；Bcl-2；Bax；Fas

1承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院手術(shù)部

第一作者：王志學(xué)(1978-)，男，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師，講師，主要從事癌痛治療對(duì)腫瘤生物學(xué)行為影響方面的研究。

綜合治療乳腺癌的研究中，人們更關(guān)注用于癌痛治療的阿片類(lèi)藥物對(duì)化療藥物抗腫瘤作用的影響。筆者前期的一些研究證實(shí)〔1～6〕，單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用嗎啡、5-氟尿嘧啶(FU)，在一定濃度范圍內(nèi)能抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖；聯(lián)合應(yīng)用兩類(lèi)藥物，可通過(guò)在細(xì)胞周期G0/G1期到S期轉(zhuǎn)化的抑制、S期向G2M期轉(zhuǎn)化的抑制上表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞周期影響的協(xié)同效應(yīng)；單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用嗎啡、5-FU，在一定濃度范圍內(nèi)可促進(jìn)MCF-7乳腺癌細(xì)胞凋亡，并使Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax、Fas、Caspase-8表達(dá)上調(diào)，聯(lián)合應(yīng)用兩類(lèi)藥物可能在內(nèi)源性、外源性途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡上顯示協(xié)同效應(yīng)。同為阿片類(lèi)藥物的芬太尼，因?yàn)榫哂懈嗟膭┬秃凸に嚥粩喑霈F(xiàn)，近年來(lái)更多地用于癌痛治療。以往的研究指出〔7～9〕，其也能劑量依賴(lài)性地抑制MCF-7人乳腺癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡，并能使腫瘤細(xì)胞所致的組織破壞顯著減少。然而，芬太尼與5-FU聯(lián)合應(yīng)用是否也有嗎啡類(lèi)似的效應(yīng)尚有待闡明。對(duì)于此，筆者前期也做了相關(guān)實(shí)驗(yàn)〔10〕。本文將對(duì)芬太尼與5-FU聯(lián)合應(yīng)用對(duì)凋亡的影響以及內(nèi)、外源性途徑的機(jī)制進(jìn)行相關(guān)探討。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1主要試劑和儀器PI(碘化丙啶)，Sigma公司(美國(guó))；Annexin V-EGFP，凱基公司(南京)；胎牛血清、胰蛋白酶，天津血液學(xué)研究所；RPMI1640培養(yǎng)基，GIBCOBRL公司(美國(guó))；鼠抗人Bcl-2、Bax、Fas免疫化學(xué)單克隆抗體，邁新公司(福州)。FACSCalibur流式細(xì)胞儀，B&D公司(美國(guó))； YT-CJ-1N超凈工作臺(tái)，亞泰科隆實(shí)驗(yàn)科技開(kāi)發(fā)中心(北京)； CO2電熱恒溫培養(yǎng)箱， SANYO公司(日本)； LD5-IA低速離心機(jī)、QL-901振蕩器，雷勃爾公司(北京)；倒置顯微鏡、光學(xué)顯微鏡，OLYMPUS(日本)；數(shù)碼攝像系統(tǒng)、顯微采圖系統(tǒng)、熒光倒置顯微鏡，尼康(日本)； Mivnt顯微圖像分析系統(tǒng)，微宇公司(珠海)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物5-FU注射液，旭東海普藥業(yè)(上海)；枸櫞酸芬太尼注射液，人福藥業(yè)(宜昌)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)細(xì)胞MCF-7人乳腺癌細(xì)胞，凱基公司(南京)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)成功復(fù)蘇細(xì)胞后，調(diào)整其濃度為1×106/ml，于培養(yǎng)瓶接種，在5%CO2、溫度37℃、濕度100%的電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置，以RPMI1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，并隔日更換培養(yǎng)液。待觀察到70%～80%貼壁時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化并進(jìn)行傳代。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組MCF-7細(xì)胞分別用含不同種類(lèi)或濃度實(shí)驗(yàn)藥物的RPMI1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，共分為8組：僅以RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)即未處理組(U組)，含0.1 μmol/L(低濃度)芬太尼的培養(yǎng)液處理組(LF組)，含1 μmol/L(中濃度)芬太尼的培養(yǎng)液處理組(MF組)，含10 μmol/L(高濃度)芬太尼的培養(yǎng)液處理組(HF組)，含500 μmol/L 5-FU的培養(yǎng)液處理組(FU組)，含0.1 μmol/L(低濃度)芬太尼與500 μmol/L 5-FU的培養(yǎng)液聯(lián)合處理組(LF+FU組)，含1 μmol/L(中濃度)芬太尼與500 μmol/L 5-FU的培養(yǎng)液聯(lián)合處理組(MF+FU組)，含10 μmol/L(高濃度)芬太尼與500 μmol/L 5-FU的培養(yǎng)液聯(lián)合處理組(HF+FU組)。

1.2.3FCM檢測(cè)Annexin V-EGFP/ PI染色的細(xì)胞凋亡情況取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，將其濃度調(diào)整為5×105/ml，在25 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中接種，觀察細(xì)胞貼壁后，用含不同種類(lèi)或濃度實(shí)驗(yàn)藥物的RPMI1640培養(yǎng)液5 ml換液(見(jiàn)1.2.2)，孵育48 h，每組5瓶。48 h后將上清吸棄，細(xì)胞消化、PBS洗滌，在離心管中收集約106/ml以上的細(xì)胞；4℃ 1 500 r/min低速離心5 min后將上清棄去， 以500 μl的Binding緩沖液重懸，再加入Annexin V-EGFP 5 μl及PI 5 μl，混勻，在室溫避光反應(yīng)15 min；后1 h內(nèi)上機(jī)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)Bcl-2、Bax、Fas表達(dá)另取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，將其制備為單細(xì)胞懸液，準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，調(diào)整到約為4×105/ml的細(xì)胞濃度，在1 cm×1 cm蓋玻片(已預(yù)先置于培養(yǎng)皿中)上接種，每片0.5 ml。觀察貼壁后，向培養(yǎng)皿中分別加入含不同種類(lèi)或濃度實(shí)驗(yàn)藥物的RPMI1640培養(yǎng)液(見(jiàn)1.2.2)孵育48 h。48 h后4℃丙酮固定大于20 min、自然風(fēng)干，PBS沖洗；50 μl 13%過(guò)氧化氫孵育，PBS再?zèng)_洗；然后用50 μl血清封閉20 min。除去血清，加50 μl一抗，4℃過(guò)夜，次日PBS沖洗。加50 μl二抗，室溫環(huán)境下孵育15～20 min后PBS沖洗。加100 μl新鮮配制的DAB溶液，在顯微鏡下觀察3～5 min。蘇木素復(fù)染，返藍(lán)，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。用Nikon Eclipse 50i顯微采圖系統(tǒng)對(duì)染色后載玻片上的Bcl-2、Bax、Fas免疫陽(yáng)性物進(jìn)行采圖，再以MiVnt顯微圖像分析系統(tǒng)對(duì)其定量分析。每個(gè)對(duì)照組或?qū)嶒?yàn)組測(cè)量5張玻片，200倍鏡下對(duì)每張玻片隨機(jī)選取5個(gè)不同視野成像，檢測(cè)其平均灰度級(jí)，即代表1張玻片上陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度(AGL)。AGL數(shù)值越大，蛋白表達(dá)水平越低。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS11.5軟件進(jìn)行單因素方差分析與析因設(shè)計(jì)方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1凋亡率變化情況與U組相比，1 μmol/L及10 μmol/L的芬太尼單獨(dú)處理48 h凋亡率均增加(P<0.05，P<0.01)；500 μmol/L 5-FU單獨(dú)處理48 h，凋亡率亦增加(P<0.01)。聯(lián)合應(yīng)用不同濃度芬太尼與500 μmol/L 5-FU 處理48 h，較各自單獨(dú)處理組相比，凋亡率亦均明顯增加(P<0.01)，且均顯示出協(xié)同效應(yīng)(P<0.01)；隨其中芬太尼濃度增加，凋亡率依次增加。見(jiàn)表1。

2.2免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)Bcl-2、Bax、Fas蛋白表達(dá)情況免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)Bcl-2蛋白表達(dá)時(shí)，U組的絕大多數(shù)細(xì)胞質(zhì)可見(jiàn)棕黃色的染色，數(shù)據(jù)顯示為最小的AGL、最強(qiáng)的Bcl-2表達(dá)。芬太尼單獨(dú)處理48 h，胞質(zhì)棕黃色染色隨著芬太尼濃度的增加依次減淺、AGL隨之增加。免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)Bax蛋白表達(dá)時(shí)，U組的絕大多數(shù)細(xì)胞質(zhì)可見(jiàn)棕黃色染色不明顯，數(shù)據(jù)顯示為最大的AGL、最弱的Bax表達(dá)。芬太尼單獨(dú)處理48 h，胞質(zhì)棕黃色染色隨著芬太尼濃度的增加依次加深、AGL隨之降低。免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)Fas蛋白表達(dá)時(shí)，U組的絕大多數(shù)細(xì)胞質(zhì)可見(jiàn)棕黃色染色不明顯，數(shù)據(jù)顯示為最大的AGL、最弱的Fas表達(dá)。芬太尼單獨(dú)處理48 h，胞質(zhì)棕黃色染色隨著芬太尼濃度的增加依次加深、AGL隨之降低。與U組相比，1 μmol/L及10 μmol/L濃度的芬太尼均能減弱Bcl-2表達(dá)、增強(qiáng)Bax、Fas表達(dá)(P<0.01)。500 μmol/L 5-FU單獨(dú)處理48 h，與未處理組相比亦能減弱Bcl-2表達(dá)、增強(qiáng)Bax、Fas表達(dá)(P<0.01)。聯(lián)合應(yīng)用不同濃度芬太尼與500 μmol/L 5-FU處理48 h，較各自單獨(dú)處理組相比，均能明顯減弱Bcl-2表達(dá)、增強(qiáng)Bax、Fas表達(dá)(P<0.01)，且均顯示出協(xié)同效應(yīng)(P<0.05)；且隨其中芬太尼濃度增加，Bcl-2表達(dá)依次減弱，Bax、Fas表達(dá)依次增強(qiáng)。見(jiàn)表1。

組別細(xì)胞凋亡率(%)Bcl-2AGLBaxAGLFasAGLU組3.394±0.900144.183±3.903260.783±20.622270.654±13.213LF組3.682±0.939148.490±4.025256.072±7.252268.411±14491MF組5.040±0.6981)164.191±8.7531)219.307±12.3582)228.099±9.1712)HF組9.020±1.0652)194.176±8.2642)197.957±9.7442)194.626±11.3282)LF+FU組18.352±2.1192)3)5)224.226±17.4322)3)4)156.639±12.2262)3)4)161.199±10.6072)3)4)MF+FU組21.862±2.3612)3)5)245.779±33.9302)3)4)132.345±5.7892)3)4)131.814±6.8522)3)4)HF+FU組28.478±3.0862)3)5)266.635±26.7762)3)4)105.809±9.1962)3)4)100.329±4.6362)3)4)FU組12.210±1.7382)168.491±9.4932)191.380±12.0792)192.625±10.8002)

與U組相比：1)P<0.05，2)P<0.01；與相應(yīng)單獨(dú)處理組相比：3)P<0.01；協(xié)同作用出現(xiàn)：4)P<0.05，5)P<0.01

3討論

阿片類(lèi)藥物通過(guò)多種機(jī)制影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，芬太尼抑制腫瘤生長(zhǎng)的機(jī)制之一即是誘導(dǎo)凋亡〔7～9〕?；煹拇硭幬?-FU可通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡亦早已證實(shí)。本研究發(fā)現(xiàn)，芬太尼、5-FU在一定濃度范圍內(nèi)單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用可促進(jìn)MCF-7乳腺癌細(xì)胞凋亡，并與其中芬太尼有明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系，聯(lián)合應(yīng)用兩類(lèi)藥物顯示出協(xié)同效應(yīng)。

誘導(dǎo)人類(lèi)細(xì)胞凋亡主要有外源性凋亡途徑和內(nèi)源性凋亡途徑兩種。外源性途徑是由細(xì)胞膜表面的死亡受體觸發(fā)，而內(nèi)源性途徑包括Bcl-2家族蛋白調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體膜完整性方面的改變，以及對(duì)細(xì)胞損害或應(yīng)激信號(hào)做出的潛在反應(yīng)。凋亡的發(fā)生與否還有賴(lài)于Bcl-2/Bax這對(duì)抗凋亡/促凋亡蛋白之間的平衡〔11〕。Bcl-2可穩(wěn)定線(xiàn)粒體膜，防止細(xì)胞色素C進(jìn)入胞質(zhì)；而B(niǎo)ax恰恰相反。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，芬太尼、5-FU在一定濃度范圍內(nèi)單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用均可顯著下調(diào)MCF-7乳腺癌細(xì)胞Bcl-2表達(dá)、上調(diào)Bax表達(dá)，兩藥聯(lián)合應(yīng)用更顯示出協(xié)同效應(yīng)。這也提示兩藥聯(lián)合應(yīng)用可能是依賴(lài)線(xiàn)粒體途徑發(fā)揮協(xié)同作用促進(jìn)細(xì)胞凋亡。另外，一旦細(xì)胞受到某些凋亡信號(hào)刺激，F(xiàn)as被Fas-L占據(jù)后會(huì)導(dǎo)致受體聚合，向Fas表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)傳遞死亡信號(hào)，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體〔12〕。本研究結(jié)果提示聯(lián)合應(yīng)用兩藥也可能在通過(guò)死亡受體途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡上發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)。以上結(jié)果顯示，兩藥聯(lián)合應(yīng)用既能在內(nèi)源性途徑、又能在外源性途徑發(fā)揮協(xié)同作用，更有利于觸發(fā)caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起細(xì)胞凋亡〔13〕。

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〔2015-10-23修回〕

(編輯曲莉)

The Apoptosis in MCF-7 breast cancer cells induced by fentanyl in combination with 5-Fluouracil and the mechanism

WANG Zhi-Xue,ZHANG Xiao-Xia,LEI Yan,etal.

Department of Anesthesiology,the Affiliated Hospital of Chengde Medical College ,Chengde 067000,Hebei,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of fentanyl in combination with 5-FU on apoptosis and the regulation mechanism of the intrinsic and extrinsic pathways in MCF-7 breast cancer cells.MethodsAfter treated with different concentration of fentanyl in combination with 5-FU for 48 h,the percentage of apoptotic cells was measured by FCM through Annexin V-EGFP/ PI staining,and the expressions of Bcl-2,Bax and Fas were detected by immunocytochemistry.ResultsAfter treated with 1 μmol/L as well as 10 μmol/L of fentanyl alone,the percentage of apoptosis and expressions of Bax and Fas were increased significantly(P<0.05,P<0.01),while the expression of Bcl-2 was decreased significantly(P<0.05，P<0.01).Similarly,the apoptosis rate and expressions of Bax and Fas also were increased remarkably(P<0.01),but the expression of Bcl-2 was decreased significantly(P<0.01),when cancer cells treated with 5-FU alone. Treated with different concentration of fentanyl combined with 5-FU,the apoptosis rate and expressions of Bax and Fas were increased more remarkably than those treated with two agents alone(P<0.01),meanwhile the expression of Bcl-2 was decreased significantly(P<0.01),including that there was a synergistic effects between fentanyl and 5-FU in induction of breast cancer cell apoptosis(P<0.05，P<0.01).ConclusionsCertain concentration of fentanyl,5-FU and the combination of the two agents could promote apoptosis of MCF-7 breast cancer cells,which result from significant down-regulating expression of Bcl-2 and up-regulating expression of Bax and activation of the intrinsic pathways. Combination of fentanyl and 5-FU shows synergisms effects.

【Key words】Fentanyl;5-Fluouracil;MCF-7;Apoptosis;Bcl-2；Bax；Fas

通訊作者：劉新偉(1973-)，男，副主任醫(yī)師， 主要從事麻醉藥理方面的研究。

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R73-36；R34〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)23-6705-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.026