李艷君　董麗華　劉大偉　李永明　宋巍巍　田國(guó)忠

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江　佳木斯　154007)

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安多霖膠囊對(duì)高頻電磁輻射損傷大鼠海馬組織的保護(hù)作用

李艷君董麗華1劉大偉1李永明宋巍巍2田國(guó)忠

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯154007)

摘要〔〕目的觀察高頻輻射后大鼠海馬區(qū)血腦屏障(BBB)的變化和caspase-3蛋白的表達(dá)及安多霖膠囊的防護(hù)效果。方法鼠齡8周的健康SD大鼠，隨機(jī)分為正常組(A組)，模型組(B組)、安多霖低濃度組(C組)、安多霖高濃度組(D組)。先飼養(yǎng)7 d使其適應(yīng)環(huán)境后，A組和B組用生理鹽水灌胃，C組和D組給予不同濃度安多霖灌胃。于給藥第10天，對(duì)B、C、D組大鼠進(jìn)行高頻輻射后24 h，斷頭，取材。采用透射電鏡技術(shù)檢測(cè)海馬組織中血腦屏障結(jié)構(gòu)變化。免疫組化S-P法檢測(cè)海馬組織中錐體細(xì)胞和齒狀回顆粒細(xì)胞caspase-3蛋白表達(dá)情況。結(jié)果透射電子顯微鏡下可見C組硝酸鑭顆粒主要沉積在毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接(TJ)處，少量鑭顆粒穿過(guò)TJ處。星形膠質(zhì)細(xì)胞周圍亦見少量鑭顆粒沉積。D組硝酸鑭顆粒主要沉積在基膜外側(cè)，未穿過(guò)TJ處。星形膠質(zhì)細(xì)胞周圍亦未見有鑭顆粒沉積。caspase-3表達(dá)量C組低于B組(P<0.05)，D組低于B組(P<0.05)，D組較C組低(P<0.05)。結(jié)論安多霖膠囊可有效防護(hù)高頻輻射損傷大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。

關(guān)鍵詞〔〕電磁輻射；安多霖膠囊；caspase-3蛋白；血腦屏障

1佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院2黑龍江省林業(yè)衛(wèi)校

第一作者：李艷君(1965-)，女，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事腦保護(hù)藥物研究。

一定強(qiáng)度的電磁輻射足可以讓腦組織功能和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，中樞神經(jīng)系統(tǒng)更為嚴(yán)重和敏感〔1〕。海馬是人類學(xué)習(xí)記憶的重要區(qū)域，電磁場(chǎng)對(duì)海馬的傷害可致使學(xué)習(xí)記憶的功能受到影響〔2〕。安多霖膠囊是一種純中藥復(fù)方制劑，由黃芪、雞血藤等中藥制成，是一種新型的抗電離輻射藥物，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，它可明顯提高機(jī)體的抗應(yīng)激能力，提升機(jī)體免疫功能〔3〕，已應(yīng)用于降低放療和化療領(lǐng)域，既無(wú)副作用也無(wú)不良反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)觀察電磁輻射對(duì)SD大鼠海馬區(qū)的損害及安多霖膠囊對(duì)其防護(hù)作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)分組、給藥及模型制備將40只SD大鼠(8周齡，體重220～280 g，大連動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室提供)，隨機(jī)分為正常組(A組，生理鹽水，2 ml·kg-1·d-1)，模型輻照組(B組，生理鹽水，2 ml·kg-1·d-1)、安多霖低濃度組(C組，安多霖2 g·kg-1·d-1)、安多霖高濃度組(D組，安多霖4 g·kg-1·d-1)，每組10只。在實(shí)驗(yàn)室條件下，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由飲水、攝食。均采用灌胃給藥法，1次/d。用藥10 d后除A組外，其余各組均給予高頻輻射，時(shí)間及功率為輻射距離71 m，輻射高度25 m。輻射坐標(biāo)：北緯：46.38’、52.97”(62’)，東經(jīng)：130.18’、21.83’。海拔：293 m，照射時(shí)間：200 min，輻射功率：45 kW/m2。

1.2材料高頻率電磁輻射源由某部測(cè)控站提供，輻照裝置: 大鼠置于有呼吸孔的塑料輻照盒中,自由體位；安多霖膠囊( 福州阿多拉制藥有限公司)；硝酸鑭戊二醛固定液( 佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院電鏡室提供) 。

1.3免疫組化S-P法檢測(cè)大鼠腦組織caspase-3蛋白表達(dá)情況在輻射后第24小時(shí)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；5%牛血清白蛋白(BSA)羊血清工作液封閉過(guò)夜，以caspase-3的鼠源抗血清為Ⅰ抗，羊抗鼠IgG為Ⅱ抗；DAB顯色。

1.4透射電子顯微鏡(TEM)檢測(cè)血腦屏障(BBB)于輻射后24 h時(shí)，用10%的水合氯醛麻醉大鼠，先用生理鹽水于右心耳緩慢沖洗干凈大鼠體內(nèi)血液，后用硝酸鑭-戊二醛固定液40 ml快速固定，斷頭取腦后，放入硝酸鑭-戊二醛中繼續(xù)固定。標(biāo)本采集：把灌注好的鼠腦切成1 mm3的小塊后分別在硝酸鑭-戊二醛和2%的硝酸鑭-四氧化鋨中進(jìn)行前后固定，再用0.1 mol/L二甲胂酸鈉緩沖液(pH7.2～7.4) 漂洗，丙酮梯度脫水，丙酮+包埋劑(1∶1)浸透過(guò)夜，812環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛進(jìn)行雙染，最后在JEM22000EX型透射電鏡下觀察，拍片。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析。

2結(jié)果

2.1caspase-3蛋白的表達(dá)A組caspase-3蛋白表達(dá)量為(0.012±0.002)，C組caspase-3表達(dá)量(0.094±0.013)低于B組(0.187±0.014)(P<0.05)，D組(0.063±0.014)低于B組(P<0.05)，D組較C組低(P<0.05)。海馬組織DG區(qū)、CA3區(qū)caspase-3表達(dá)見圖1。

2.2BBB通透性的測(cè)定A組TEM下可見BBB結(jié)構(gòu)完好，間隙正常，硝酸鑭顆粒主要沉積在基膜外側(cè)，未穿過(guò)緊密連接(TJ)。B組TJ處也可見鑭顆粒沉積，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(BCECs) TJ間隙明顯增寬，間隙內(nèi)可見鑭顆粒沉積，鑭顆粒甚至可達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞周圍。C組少量鑭顆粒穿過(guò)TJ沉積在BCECs TJ，星形膠質(zhì)細(xì)胞周圍亦可見少量鑭顆粒沉積。D組雖有少量硝酸鑭顆粒穿過(guò)TJ，但較C組已有明顯改善，星形膠質(zhì)細(xì)胞周圍未見有鑭顆粒，見圖2。

圖1　各組海馬組織DG區(qū)、CA3區(qū)caspase-3蛋白表達(dá)(×200)

A組

B組

C組

D組

圖2各組BBB通透性(×20 000)3討論

caspase-3對(duì)細(xì)胞的凋亡起著關(guān)鍵的作用，它的增加會(huì)引起很多酶或蛋白發(fā)生變化，致使細(xì)胞凋亡。 caspase-3正常存在于胞質(zhì)內(nèi),沒有活性,是前體,它可以通過(guò)兩條途徑進(jìn)行活化，其一由于損傷作用,細(xì)胞色素C可通過(guò)線粒體的釋放，激活caspase-9,進(jìn)而激活caspase-3,誘發(fā)凋亡〔4〕；另外，壞死因子或死亡受體可被蛋白所介導(dǎo),接觸到死亡結(jié)構(gòu),引起caspase-1,-6,-8和-10活化，誘導(dǎo)效應(yīng)酶caspase-2,-3及-7發(fā)生凋亡反應(yīng)，以上可以認(rèn)為caspase-3 在各種因素啟動(dòng)的凋亡程序中，都起到最后的樞紐作用。研究表明〔5〕，在海馬的CA3區(qū)和DG區(qū)中，caspase-3的表達(dá)增加是海馬神經(jīng)元凋亡的主要原因。

BBB正常生理狀態(tài)下TJ是致密的，可使神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。當(dāng)BBB被破壞時(shí)，調(diào)節(jié)BBB TJ功能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制可造成微循環(huán)結(jié)構(gòu)滲透壓平衡失調(diào)，產(chǎn)生血管源性腦水腫。伴隨信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生的變化，海馬組織中的一些受體也會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致通透性的改變，進(jìn)而促使細(xì)胞發(fā)生凋亡導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶損壞。綜上，安多霖對(duì)于高頻輻射的損傷有一定的預(yù)防作用。

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〔2014-09-19修回〕

(編輯苑云杰)

通訊作者：田國(guó)忠(1966-)，男,博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事慢性心力衰竭研究。

基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究面上項(xiàng)目(No.12531670)

中圖分類號(hào)〔〕R135.99〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)23-6698-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.023