尚曉玲　張家穎　公培剛　劉愛東　陸培信　胡亞男

(長春中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，吉林　長春　130117)

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益腎達絡飲對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠CREB、P-CREB表達的影響

尚曉玲張家穎1公培剛1劉愛東2陸培信1胡亞男

(長春中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，吉林長春130117)

摘要〔〕目的觀察中藥復方益腎達絡飲治療的實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中cAMP反應元件結合蛋白(CREB)磷酸化水平，探討其對小鼠中樞神經(jīng)損傷的可能作用機制。方法建立小鼠EAE動物模型，采用蛋白免疫印跡技術檢測正常對照組、模型組、中藥組、激素組、中藥加激素組、抑制劑組小鼠腦和脊髓中CREB、P-CREB的表達量，并計算CREB磷酸化水平(P-CREB/CREB)。結果在腦組織中，中藥組P-CREB相對表達量及CREB磷酸化水平(P-CREB/CREB)與其余各組比較均顯著升高(P<0.01)；中藥組、中藥加+激素組和激素組CREB磷酸化水平依次降低(兩兩比較P<0.01)。在脊髓組織中，中藥組P-CREB相對表達量均高于模型組(P<0.01)、對照組(P<0.05)和抑制劑組(P<0.05)；中藥組、中藥+激素組及激素組CREB磷酸化水平均高于模型組(P<0.05)，這3組之間兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論益腎達絡飲對EAE的治療作用可能與升高CREB的磷酸化水平有關。

關鍵詞〔〕實驗性自身免疫性腦脊髓炎；多發(fā)性硬化；益腎達絡飲；CREB；P-CREB

1吉林大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學實驗中心

2長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院

第一作者：尚曉玲(1975-)，女，副教授，主要從事中醫(yī)藏象理論與應用研究。

多發(fā)性硬化(MS)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，給患者帶來巨大的身心痛苦?，F(xiàn)有研究表明，以益腎、解毒、通絡立法的中藥復方益腎達絡飲對MS有較好的療效〔1〕，其治療機制仍在探討中。cAMP反應元件結合蛋白(CREB)是一種核轉(zhuǎn)錄因子，磷酸化的CREB(P-CREB)可調(diào)控下游基因表達，在神經(jīng)元的發(fā)育、再生及突觸形成等神經(jīng)生理活動中發(fā)揮著重要作用〔2〕。本研究通過檢測MS動物模型實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠腦和脊髓組織中CREB磷酸化水平，探討MS的發(fā)病機制及其中藥治療與CREB磷酸化水平的關系，為尋找治療MS的分子靶點提供依據(jù)。

1材料和方法

1.1實驗動物SPF級8～12周齡SJL/J雌性小鼠24只，體質(zhì)量18～20 g，由美國Jackson實驗室提供，飼養(yǎng)于吉林大學實驗動物中心。

1.2實驗藥品與試劑髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)139-151多肽HSLGKWLGHPDKF(純度85%以上)購自北京賽百盛生物工程公司；百日咳桿菌購自北京生物制品研究所；完全福氏免疫佐劑(CFA)、SB203580購自美國Sigma公司；醋酸潑尼松購自天津天藥藥業(yè)公司；益腎達絡飲由熟地、鹿角膠、梔子、生甘草、石菖蒲等組成，飲片購自長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥房；兔抗小鼠CREB、P-CREB抗體購自Cell Signaling公司；內(nèi)參蛋白兔抗小鼠Tubulin抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG、BCA蛋白定量試劑盒及ECL化學發(fā)光試劑盒均購自碧云天公司。醋酸潑尼松經(jīng)研缽粉碎后用無菌水溶解，配成0.039%(質(zhì)量濃度)的使用液；SB203580用2%二甲基亞砜配制成1 mmol/L溶液；益腎達絡飲經(jīng)水煎法煎煮，過濾后收集濾液合并煎煮濃縮制成2 g生藥/ml的水提物，滅菌分裝。

1.3動物分組及EAE模型制備實驗小鼠隨機分為健康對照組(對照組)、中藥組、糖皮質(zhì)激素組(激素組)、中藥+激素組、抑制劑組及模型組，每組4只。對照組小鼠正常飼養(yǎng)，其余各組按下述方法制備EAE動物模型〔3〕：將1.5 μg/μl的PLP 139-151抗原水溶液100 μl與100 μl完全福氏佐劑混合制成抗原配劑。第1天給予小鼠上腹部皮下注射200 μl抗原配劑，當天和第3天經(jīng)靜脈注射6.0×103/μl百日咳桿菌液100 μl。

1.4模型動物給藥自造模操作后第8天始，中藥組按體質(zhì)量2 g生藥·kg-1·d-1給予益腎達絡飲0.2 ml，激素組按體質(zhì)量0.078 mg·kg-1·d-1給予醋酸潑尼松0.2 ml，中藥+激素組按體質(zhì)量2 g生藥量·kg-1·d-1及0.078 mg·kg-1·d-1醋酸潑尼松給予混合溶液0.2 ml，模型組予生理鹽水0.2 ml/d，灌胃14 d，給藥體積不足0.2 ml者用生理鹽水補足。抑制劑組于造模第8天按體質(zhì)量5 mg/kg腹腔注射SB203580〔4〕1次，此后每6 d給藥1次，共給藥3次。

1.5蛋白免疫印跡技術檢測CREB、P-CREB表達造模后第

22天取所有組實驗小鼠腦與脊髓組織，提取組織蛋白，以BCA法定量，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，一抗(兔抗小鼠CREB和P-CREB)和二抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG)孵育ECL化學發(fā)光法顯影，應用Image J軟件計算蛋白條帶的灰度值(與蛋白彩色預染分子量marker比對相對分子質(zhì)量，看蛋白條帶的分子量是否相近)，并計算CREB與P-CREB相對表達量及CREB磷酸化水平。CREB與P-CREB兩蛋白的相對表達量分別為其蛋白條帶灰度與內(nèi)參Tubulin條帶灰度的比值，CREB磷酸化水平=P-CREB相對表達量/CREB相對表達量。

2結果

腦組織中P-CREB相對表達量，中藥組與其余各組比較均顯著升高(P<0.01)，抑制劑組與激素組和模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，中藥+激素組與對照組、模型組和抑制劑組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；脊髓組織中P-CREB相對表達量中藥組高于模型組(P<0.01)、對照組(P<0.05)和抑制劑組(P<0.05)，激素組高于模型組(P<0.05)和抑制劑組(P<0.05)，中藥組、激素組及中藥+激素組兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1，圖1。

A：對照組：B：中藥組；C：激素組；D：中藥+激素組；E：模型組；F：抑制劑組圖1　各組腦與脊髓組織CREB、P-CREB相對表達比較

組別腦組織P-CREBCREBP-CREB/CREB脊髓組織P-CREBCREBP-CREB/CREB抑制劑組0.562±0.672)8)0.979±0.062)4)6)8)10)0.576±0.083)8)10)0.366±0.136)8)10)0.370±0.022)4)5)7)0.986±0.374)中藥+激素組0.445±0.108)0.299±0.022)4)6)1.482±0.272)3)6)8)0.556±0.176)8)0.516±0.021)4)1.073±0.294)中藥組0.801±0.082)4)6)10)0.244±0.032)4)6)3.301±0.362)4)6)10)0.769±0.191)4)6)10)0.902±0.042)3)0.849±0.183)激素組0.550±0.082)0.721±0.032)4)8)10)0.762±0.108)0.695±0.283)8)10)0.821±0.022)4)0.842±0.323)模型組0.575±0.092)0.586±0.062)6)8)10)0.982±0.138)9)0.297±0.106)7)10)0.945±0.012)5)7)0.313±0.111)5)7)10)對照組0.346±0.046)0.433±0.056)8)10)0.806±0.128)10)0.417±0.096)8)0.464±0.027)0.896±0.17

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；與激素組比較：5)P<0.05,6)P<0.01；與中藥組比較:7)P<0.05,8)P<0.01;與中藥+激素組比較：9)P<0.05,10)P<0.01

腦組織CREB磷酸化水平(P-CREB/CREB)中藥組與其余各組相比均升高(P<0.01)；激素組較對照組、模型組和抑制劑組差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，中藥+激素組高于對照組(P<0.01)、激素組(P<0.01)、模型組(P<0.05)和抑制劑組(P<0.01)；中藥組、中藥+激素組和激素組的CREB磷酸化水平依次降低(兩兩比較均P<0.01)。脊髓組織CREB磷酸化水平中藥組、中藥+激素組及激素組均高于模型組(P<0.05)，三組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

3討論

MS是一種累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性疾病，其病變分布廣泛，可累及大腦、腦干、脊髓、視神經(jīng)等處。 EAE是研究MS的經(jīng)典動物模型，MS/EAE病理特點為中樞神經(jīng)系統(tǒng)多發(fā)的白質(zhì)炎性反應、脫髓鞘和膠質(zhì)斑塊形成〔5〕。眾多研究表明，CREB在神經(jīng)元的發(fā)育、再生、突觸形成等神經(jīng)生理活動中發(fā)揮著重要作用，揭示其在MS/EAE病理機制中可能起了不可忽視的作用。北京中醫(yī)藥大學高穎教授的研究團隊創(chuàng)立了以益腎、解毒、通絡立法的中藥復方益腎達絡飲，臨床觀察表明對MS有較好的療效〔6，7〕。我研究團隊經(jīng)過多年研究已證實其治療MS/EAE機制體現(xiàn)在降低炎性反應、減輕軸索損傷、影響信號通路等方面，但是其治療的信號通路機制還未完全弄清楚。

CREB的活化是靠自身磷酸化來介導的，尤其是133位絲氨酸的磷酸化。P-CREB可以與含有cAMP反應元件結構的基因啟動子區(qū)結合，參與調(diào)節(jié)下游基因(如神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、血管內(nèi)皮生長因子等)的轉(zhuǎn)錄〔8〕。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，CREB調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞的生長發(fā)育，參與神經(jīng)細胞突觸可塑性和長時程記憶的形成過程。CREB是許多胞內(nèi)激酶的底物，其活化的通路主要有通過cAMP的蛋白激酶A激活途徑、通過Ca2+的鈣調(diào)蛋白依賴性激酶激活途徑、通過生長因子受體的蛋白激酶B激活途徑等〔9〕。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路在CREB的磷酸化過程中也發(fā)揮著重要作用，該通路可參與細胞生長、增殖和凋亡等生理過程，并影響神經(jīng)突觸可塑性〔10〕，其中p38 MAPK通路與炎性反應、應激反應的調(diào)控密切相關。

SB203580是一種p38抑制劑，能夠特異性抑制p38活性，阻斷p38 MAPK信號通路向核內(nèi)傳遞，一定程度上可以阻止CREB磷酸化。既往研究表明，SB203580能夠明顯降低EAE小鼠的神經(jīng)功能，而益腎達絡飲治療EAE的藥理機制與調(diào)節(jié)p38 MAPK通路密切相關〔6〕。醋酸潑尼松是目前臨床治療MS的常用激素，具有抗炎和免疫抑制作用。本實驗結果提示益腎達絡飲可明顯促進腦CREB的磷酸化，且效果優(yōu)于醋酸潑尼松。益腎達絡飲與醋酸潑尼松聯(lián)合用藥后，CREB的磷酸化水平并沒有表現(xiàn)出累積升高的趨勢。臨床上中藥和激素聯(lián)合用藥治療MS時，大多采用中藥藥量不變、激素緩慢減量的給藥方式，治療前期大劑量激素旨在控制病情，達到治療效果后給藥量逐漸減少直至停止激素給藥，而不是一直高劑量激素用藥，這一有效的治療方案也從另一側面印證了聯(lián)合用藥組CREB磷酸化水平不高于中藥組這一結果的合理性。

越來越多的研究表明，CREB在神經(jīng)元的發(fā)育、再生、突觸形成等神經(jīng)生理活動中發(fā)揮著重要作用〔2〕；許多神經(jīng)功能障礙疾病如阿爾茨海默病〔11〕、癲癇、癡呆、抑郁癥等都與胞內(nèi)CREB的磷酸化有關。但是關于MS發(fā)病過程中CREB、P-CREB蛋白的表達研究非常鮮見，通過上述結果我們確定EAE與CREB磷酸化水平相關，EAE模型小鼠經(jīng)中藥復方益腎達絡飲治療后，腦和脊髓中P-CREB相對表達量及CREB磷酸化水平均顯著升高，前面提到益腎達絡飲促進腦CREB的磷酸化效果優(yōu)要于激素組，這都表明中藥治療MS可能與CREB的磷酸化水平升高有關，推測CREB有可能可以作為研究和治療MS的目標分子。

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〔2015-01-17修回〕

(編輯李相軍)

Effects of Yishendaluo decoction on expressions of CREB and P-CREB in experimental autoimmune encephalomyelitis mice

SHANG Xiao-Ling, ZHANG Jia-Ying, GONG Pei-Gang,etal.

Department of Basic Theory of Traditional Chinese Medicine，Changchun 130117，Jilin, China

【Abstract】ObjectiveTo Investigate the phosphorylation level of CREB (cAMP response element-binding protein) in central nervous system of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) mice, in order to explore the mechanism of Yishendaluo decoction on the therapy of central nervous system injury.MethodsEAE mice models were established, and different interference therapies were treated with Yishendaluo decoction-treated, hormone-treated, Yishendaluo decoction-hormone treated and inhibitor-treated groups，every group had four mice. Western blot was used to determine the expressions of CREB and P-CREB proteins in brain and spinal cord tissue of the EAE mice.ResultsIn mice brain tissue, the expression of P-CREB/CREB in Yishendaluo decoction-treated group was higher than that of other groups (all P<0.01); the phosphorylation level of CREB was declining in Yishendaluo decoction-treated, Yishendaluo decoction-hormone treated and only hormone-treated groups(all P>0.05). In spinal cord tissue, the level of P-CREB protein in Yishendaluo decoction-treated group was higher than that of model group (P<0.01), normal group (P<0.05) and SB203580-treated group (P<0.05); The phosphorylation levels of CREB in Yishendaluo decoction-treated, Yishendaluo decoction-hormone treated and only hormone-treated groups were higher than those of model group (P<0.05), but there′s no significant difference among these three groups (all P>0.05).ConclusionsTo a certain extent, the mechanism of Yishendaluo decoction on EAE mice might be associated with the phosphorylation level of CREB.

【Key words】Experimental autoimmune encephalomyelitis；Multiple sclerosis；Yishendaluo decoction；CREB；P-CREB

通訊作者：胡亞男(1978-)，女，在讀博士，講師，主要從事神經(jīng)腦病學研究。

基金項目：國家自然科學基金資助項目(30901893)；吉林省科技廳自然科學基金資助項目(201215158)

中圖分類號〔〕R744.5+1〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6677-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.015