鄭　敏　謝琳娜　曾燕華　林德馨

(福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，福建　福州　350108)

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CD44、CD133及EpCAM與肝癌細胞成瘤性及耐藥性的相關(guān)性

鄭敏謝琳娜1曾燕華林德馨

(福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，福建福州350108)

摘要〔〕目的探討細胞表面標志物組合與肝癌細胞的成瘤性及其對藥物抗性的相關(guān)性。方法利用目前廣泛用于肝癌干細胞鑒定與分離的三種細胞表面標志物(CD44、CD133和EpCAM)對幾種肝癌細胞進行表面標志物表達分析，并通過腫瘤體外移植實驗研究細胞成瘤性，用抗癌藥索拉非尼處理細胞，觀察不同類型細胞的耐藥性。結(jié)果Hep3B、SK-Hep-1和SNU182這三株細胞具有三種截然不同的細胞表面標志物組合表達模式。CD44陽性與STAT3的激活和細胞對索拉非尼的抗性相關(guān)，而CD133/EpCAM雙陽性則與低成瘤性相關(guān)。結(jié)論該研究為肝癌干細胞的組合式分選鑒定的探索提供了新思路。

關(guān)鍵詞〔〕細胞表面標志物；腫瘤干細胞；肝癌；索拉非尼

1福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院健康產(chǎn)業(yè)研究院食品與生物工程系

第一作者：鄭敏(1982-)，男，講師，博士，主要從事腫瘤生物學(xué)研究。

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，五年生存率極低〔1〕。索拉非尼是美國FDA在2007年批準的晚期肝癌的靶向治療藥物〔2,3〕。由于肝癌細胞的高耐藥性和轉(zhuǎn)移性，肝癌在術(shù)后仍有較高的復(fù)發(fā)率。目前，已有多種細胞表面標志物被用于從肝癌細胞系甚至是人類肝癌樣本中鑒別和分離腫瘤干細胞〔4〕，其中CD133是最早被用于富集和分離肝癌干細胞的表面標志物〔5〕。有研究〔6,7〕指出， CD133+/CD44+和EpCAM+/CD133+細胞群均比其他亞群的細胞具有更強的腫瘤干細胞特征。但是，在其他肝癌細胞中這3個細胞表面標志物與腫瘤干細胞特征的相關(guān)性研究尚未見報道。本研究擬探討CD44、CD133和EpCAM的表達情況與肝癌細胞成瘤性及對索拉非尼耐藥性的關(guān)系。

1材料和方法

1.1實驗材料DMEM(貨號SH30022.01B)購自賽默飛世爾公司。胎牛血清(貨號100-500)購自Gem Cell TM公司。E-cadherin抗體(貨號BD610181)購自BD公司。STAT3-Y705磷酸化抗體(貨號ab76315) 購自Abcam公司。gamma-tubulin抗體(貨號T6557)購自Sigma公司。β-akt-T308磷酸化抗體(貨號9275L)和Erk1/2-T202/Y204(貨號4370s)磷酸化抗體購自Cell Signaling公司。β-actin抗體(貨號sc-32251)購自Santa Cruz公司。PE耦聯(lián)的CD133抗體(貨號130-080-801)購自Miltenyi Biotec公司。Pacific Blue耦聯(lián)的EpCAM抗體(貨號324218)購自Biolegend公司。大鼠活化蛋白(APC)耦聯(lián)的CD44抗體(貨號17-0441-83)購自eBiosciences公司。SNU182，Hep3B和SK-Hep-1細胞系均由美國哈佛大學(xué)盧坤平教授饋贈。細胞培養(yǎng)于含有10%血清的DMEM培養(yǎng)液中，放在含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)〔8,9〕。

1.2細胞表面標志物分析收集2×105個細胞，用相應(yīng)的抗體標記后，流式細胞分析儀進行分析〔10〕。在100 μl標記體系中，EpCAM抗體加入5 μl，CD44抗體加入2 μl，CD133抗體加入4 μl。

1.3體外成瘤實驗將5 000個細胞通過皮下注射到裸鼠背部兩側(cè)，每種細胞各進行6次生物學(xué)重復(fù)。每3～4 d檢測腫瘤形成情況。腫瘤的體積以長×寬×高計算。

1.4基于Annexin-V/PI染色的細胞凋亡分析將飄起的細胞連同貼壁細胞一同收集。按照Roche公司的Annexin-V-FLUOS染色試劑盒(貨號11988549001)的說明對處理細胞進行染色，并用流式細胞儀分析其凋亡情況。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0軟件進行分析。

2結(jié)果

圖1　CD133和EpCAM在Hep3B、SK-Hep-1和SNU182細胞的共表達分析

2.1CD44、CD133和EpCAM在肝癌細胞表面的表達流式細胞分析技術(shù)檢測結(jié)果顯示，Hep3B細胞CD133陽性98.7%、EpCAM陽性97.4%，CD44陽性0.8%；SK-Hep-1細胞中CD133陽性0.4%、EpCAM陽性6.3%，CD44陽性99.3%；在SNU182細胞中，CD44陽性率為99.0%，CD133和EpCAM的陽性率分別為68.2%、7.04%。

其中，超過95%以上的Hep3B和60%的SNU182都是EpCAM、CD133雙陽性。因為超過95%的SNU182細胞是CD44陽性，所以這群CD133、EpCAM雙陽性的SNU182細胞同時也是CD44陽性細胞?；谏鲜鼋Y(jié)果，Hep3B、SK-Hep-1和SNU182分別代表著三種帶有不同表面標志物表達方式的細胞。見圖1。

2.2CD133+/EpCAM+與低成瘤性相關(guān)腫瘤體外移植實驗結(jié)果顯示，在3個月內(nèi)，SK-Hep-1細胞可形成直徑約1 cm的腫瘤，而Hep3B和SNU182均未見腫瘤形成。 綜合各個細胞表面標志物的表達情況，這一結(jié)果提示CD133、EpCAM雙陽性與低成瘤性有關(guān)。見圖2。

圖2　Hep3B、SK-Hep-1和SNU182細胞體外成瘤實驗結(jié)果

2.3CD44+與STAT3激活和索拉非尼抗性相關(guān)在肝癌中，CD44-STAT3信號通路對于腫瘤細胞的抗凋亡十分重要〔11〕。對上述肝癌細胞內(nèi)的信號通路分析結(jié)果印證，STAT3的磷酸化修飾在CD44陽性細胞(SK-Hep-1和SNU182)中持續(xù)激活，而Erk和Akt的磷酸化則沒有顯著差異。見圖3。

圖3　Hep3B、SK-Hep-1和SNU182細胞中STAT3、Erk和Akt活性分析

用10 μmol/L的索拉非尼處理細胞，每隔12 h觀察細胞。結(jié)果顯示，大約60%的Hep3B細胞在處理72 h后飄起，而絕大多數(shù)的SK-Hep-1和SNU182細胞仍貼壁。通過基于Annexin-V和pI染色的細胞凋亡分析結(jié)果顯示，索拉非尼導(dǎo)致的細胞凋亡率在Hep3B中約為56%；在SK-Hep-1中約為11%，而在SNU182細胞中約為21%。由此可見，CD44陽性的SK-Hep-1和SNU182細胞較CD44陰性的Hep3B細胞對索拉非尼有著更加顯著的抗性。見圖4。

圖4　Hep3B、SK-Hep-1和SNU182對索拉非尼敏感性分析

3討論

腫瘤干細胞在肝癌的發(fā)生、發(fā)展和放化療抗性中發(fā)揮著十分重要的作用〔12〕。但是，肝癌干細胞的鑒定無論是在實驗室還是臨床來說仍然是限制靶向肝癌干細胞的肝癌臨床治療的一個重要瓶頸。 到目前為止，包括CD13〔13〕、CD44〔9〕、CD90〔14〕、CD133〔9,15～17〕、EpCAM〔5〕和ALDH〔13〕在內(nèi)的多種表面標志物都被用于肝癌干細胞的鑒定和分離。值得指出的是，目前仍然沒有公認的肝癌干細胞表面標志物，原因很可能與這些腫瘤表面標志物的細胞特異性有關(guān)。以往，肝癌干細胞的表面標志物是在一個特定的細胞系內(nèi)對不同亞群細胞的腫瘤干細胞特征進行比較后確立的，很少在不同細胞系之間進行比較。 即便是在不同細胞系之間發(fā)現(xiàn)差異，通常也被簡單地認為是由于細胞系之間不同遺傳背景的差異所導(dǎo)致。因而，在不同細胞系間進行細胞表面標志物與肝癌干細胞特征的相關(guān)性研究往往被人們所忽略。

本研究發(fā)現(xiàn)CD44、CD133和EpCAM在不同細胞系中有著截然不同的組合表達方式。結(jié)果提示在肝癌這種異質(zhì)性程度高的癌癥中，CD44、CD133和EpCAM或者是他們中的2個或3個表面標志物的組合并不足以用來普遍地指示肝癌干細胞的所有特征。若將表面標志物進行拆分，結(jié)果提示CD44+與STAT3的活性和細胞對索拉非尼抗性呈正相關(guān)，而CD133+/EpCAM+則與肝癌細胞的成瘤性呈負相關(guān)。這項研究結(jié)果受限于細胞系種類的數(shù)量，因而在更大范圍的肝癌細胞系中對細胞表面標志物與肝癌干細胞特征的相關(guān)性研究是十分必要的。 這些結(jié)果將有助于對已有的以及新發(fā)現(xiàn)的細胞表面標志物進行普遍性評估，以此判定其是否可以作為肝癌干細胞的表面標志物，為靶向肝癌干細胞的臨床治療提供切實可行的潛在靶點。

參考文獻4

1Forner A,Llovet JM,Bruix J.Hepatocellular carcinoma〔J〕.Lancet,2012;379(9822):1245-55.

2Llovet JM,Ricci S,Mazzaferro V,etal.Sorafenib in advanced hepatocellular carcinoma〔J〕.N Engl J Med,2008;359(3):378-90.

3Llovet JM,Hernandez-Gea V.Hepatocellular carcinoma:reasons for phase Ⅲ failure and novel perspectives on trial design〔J〕.Clin Cancer Res,2014;20(8):2072-9.

4Ji J,Wang XW.Clinical implications of cancer stem cell biology in hepatocellular carcinoma〔J〕.Semin Oncol,2012;39(4):461-72.

5Ma S,Chan KW,Hu L,etal.Identification and characterization of tumorigenic liver cancer stem/progenitor cells〔J〕.Gastroenterology,2007;132(7):2542-56.

6Zhu Z,Hao X,Yan M,etal.Cancer stem/progenitor cells are highly enriched in CD133+CD44+population in hepatocellular carcinoma〔J〕.Int J Cancer,2010;126(9):2067-78.

7Chen Y,Yu D,Zhang H,etal.CD133(+)EpCAM(+) phenotype possesses more characteristics of tumor initiating cells in hepatocellular carcinoma Huh7 cells〔J〕.Int J Biol Sci,2012;8(7):992-1004.

8Zheng M,Chen R,Zhong H,etal.Side-effects of resveratrol in HepG2 cells:reduced PTEN and increased bcl-xl mRNA expression〔J〕.Mol Med Rep,2012;6(6):1367-70.

9Fuchs BC,Fujii T,Dorfman JD,etal.Epithelial-to-mesenchymal transition and integrin-linked kinase mediate sensitivity to epidermal growth factor receptor inhibition in human hepatoma cells〔J〕.Cancer Res,2008;68:2391-9.

10Zheng M,Wang YH,Wu XN,etal.Inactivation of Rheb by PRAK-mediated phosphorylation is essential for energy-depletion-induced suppression of mTORC1〔J〕.Nature Cell Biol,2011;13(3):263-72.

11Liu Y,Li PK,Li C,etal.Inhibition of STAT3 signaling blocks the anti-apoptotic activity of IL-6 in human liver cancer cells〔J〕.J Biol Chem,2010;285(35):27429-39.

12Rountree CB,Mishra L,Willenbring H.Stem cells in liver diseases and cancer:recent advances on the path to new therapies〔J〕.Hepatology,2012;55(1):298-306.

13Haraguchi N,Ishii H,Mimori K,etal.CD13 is a therapeutic target in human liver cancer stem cells〔J〕.J Clin Invest,2010;120(9):3326-39.

14Yang ZF,Ho DW,Ng MN,etal.Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer〔J〕.Cancer Cell,2008;13(2):153-66.

15Ma S,Chan KW,Lee TK,etal.Aldehyde dehydrogenase discriminates the CD133 liver cancer stem cell populations〔J〕.Mol Cancer Res,2008;6(7):1146-53.

16Song W,Li H,Tao K,etal.Expression and clinical significance of the stem cell marker CD133 in hepatocellular carcinoma〔J〕.Int J Clin Pract,2008;62(8):1212-8.

17Ding W,Mouzaki M,You H,etal.CD133+ liver cancer stem cells from methionine adenosyl transferase 1A-deficient mice demonstrate resistance to transforming growth factor (TGF)-beta-induced apoptosis〔J〕.Hepatology,2009;49(4):1277-86.

〔2014-10-27修回〕

(編輯袁左鳴)

Correlation of CD44,CD133 and EpCAM with tumorigenicity and sorafenib resistance of liver cancer cells

ZHENG Min,XIE Lin-Na,ZENG Yan-Hua,etal.

Department of Biochemistry and Molecular Biology,School of Basic Medical Sciences,Fujian Medical University,Fuzhou 350108,Fujian,China

【Abstract】ObjectiveTo study the correlation of cell surface markers with tumorigenicity and sorafenib resistance in liver cancer cells.MethodsThe expressions of three wildly used surface markders (CD44,CD133 and EpCAM) were tested,xenograft based tumorigenicity and sorafenib sensitivity in several liver cancer cell lines were analyzed.ResultsHep3B,SK-Hep-1 and SNU182 cells were correlated with totally different surface-expression phenotypes. CD44+highly were correlated with STAT3 activation and sorafenib resistance,while CD133+/EpCAM+was associated with low cellular tumorigenicity.ConclusionsThis study might help define cell surface markers combinational pattern for identifying liver cancer stem cells.

【Key words】Surface markers；Cancer stem cells；Liver cancer；Sorafenib

基金項目：國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(31100995)；福建省中青年教師教育科研項目(JA14410)；福建省高校杰出青年科研人才項目(JA14129)

中圖分類號〔〕R735〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23--；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.011