朱　娜　要瑞莉　劉俊雙　馬俊利

(唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河北　唐山　063000)

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大鼠肢體缺血/再灌注后心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用

朱娜要瑞莉劉俊雙1馬俊利

(唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河北唐山063000)

摘要〔〕目的觀察大鼠肢體缺血/再灌注(I/R)后心肌細(xì)胞凋亡及Bcl-2/Bax表達(dá)的變化和氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用。方法健康雄性Wistar大鼠30只，隨機(jī)分成對(duì)照組、肢體I/R 2 h組(I/R 2 h組)和4 h組(I/R 4 h組)。免疫組化法檢測(cè)心肌組織Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)；原位末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(TUNEL)技術(shù)檢測(cè)心肌凋亡細(xì)胞；生化法檢測(cè)血漿心肌酶含量；比色法測(cè)定心肌組織活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量的變化。結(jié)果肢體I/R后與對(duì)照組比較，血漿心肌酶含量升高；心肌組織ROS和MDA含量增加，SOD活性降低(P<0.05)；心肌凋亡細(xì)胞明顯增加(P<0.01)；心肌組織Bcl-2與Bax表達(dá)增強(qiáng)，但Bax表達(dá)較Bcl-2明顯上調(diào)，Bcl-2/Bax比值降低(P<0.01)；相關(guān)分析顯示，ROS含量與Bax蛋白表達(dá)平均吸光度值和凋亡指數(shù)(AI)之間呈顯著正相關(guān)(P<0.01)。結(jié)論大鼠肢體I/R后可致心肌細(xì)胞凋亡；心肌細(xì)胞凋亡與Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)比值降低和心肌氧化應(yīng)激增強(qiáng)有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕缺血/再灌注；心?。坏蛲?；Bcl-2；Bax；氧化應(yīng)激

1中國(guó)人民解放軍第255醫(yī)院心內(nèi)科

第一作者：朱娜(1977-)，女，碩士，講師，主治醫(yī)師，主要從事肢體缺血再灌注損傷的防治及機(jī)制研究。

研究表明，嚴(yán)重的肢體缺血/再灌注(I/R)后可致心肌組織損傷〔1〕。臨床和實(shí)驗(yàn)證實(shí)，凋亡存在于各種心臟損傷的相關(guān)疾病過(guò)程中〔2，3〕，并對(duì)其發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生重要影響。氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的一個(gè)主要機(jī)制〔4〕，但目前對(duì)于氧化應(yīng)激通過(guò)何種機(jī)制介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡仍不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究大鼠肢體I/R后心肌細(xì)胞凋亡及Bcl-2/Bax的調(diào)節(jié)作用和氧化應(yīng)激的影響。

1材料與方法

1.1主要藥品活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，TUNEL試劑盒、Bcl-2、Bax多克隆抗體、即用型免疫組化試劑盒購(gòu)于北京中山生物技術(shù)公司。

1.2動(dòng)物分組及模型制備健康雄性Wistar大鼠(280±20)g隨機(jī)分為三組，每組10只，術(shù)前喂養(yǎng)14 d。對(duì)照組：常規(guī)飼養(yǎng)，雙后肢松弛環(huán)繞橡皮圈，不阻斷血流，其余操作同肢體I/R組。肢體I/R分為I/R 2 h和I/R 4 h組，按照文獻(xiàn)〔5〕建立大鼠肢體I/R模型。用橡皮圈環(huán)繞結(jié)扎大鼠雙后肢根部，阻斷4 h后松解，恢復(fù)血流灌注2 h和4 h后分別自大鼠腹主動(dòng)脈取血處死動(dòng)物，即刻開(kāi)胸取出心臟，于心尖部橫斷切取長(zhǎng)約0.5 cm的心肌組織放入中性甲醛固定，其余組織放入液氮-70℃保存。

1.3測(cè)定指標(biāo)

1.3.1血漿心肌酶含量的測(cè)定從腹主動(dòng)脈放血處死動(dòng)物并收集血液，取抗凝血離心后分離血漿，用HI-TACHI7200全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量。

1.3.2心肌組織ROS、MDA和SOD含量的測(cè)定取心肌組織200 mg，放入裝有2 ml冷生理鹽水制成勻漿，于低溫下經(jīng)3 500 r/min離心15 min，收集上清液，根據(jù)化學(xué)比色法分別測(cè)定ROS、MDA和SOD的含量。

1.3.3心肌細(xì)胞凋亡的原位檢測(cè)檢測(cè)方法嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作。陰性實(shí)驗(yàn)對(duì)照：經(jīng)固定和消化的樣品中加入不含末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶的標(biāo)記溶液代替TUNEL反應(yīng)混合液。細(xì)胞核呈棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞，計(jì)算6個(gè)高倍視野(×400)下的凋亡細(xì)胞數(shù)，凋亡指數(shù)(AI)以凋亡細(xì)胞/100個(gè)細(xì)胞表示。

1.3.4心肌組織Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)測(cè)定取心尖部心室肌組織，多聚甲醛固定石蠟包埋切片，按免疫組化常規(guī)操作。以0.01 mol/L PBS代替一抗為陰性對(duì)照。細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色染色者為陽(yáng)性細(xì)胞。采用Motic醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)軟件對(duì)各組大鼠心肌組織切片進(jìn)行分析，鏡下以相同外部條件攝取圖像(×200)，每張隨機(jī)選擇6個(gè)視野，得出陽(yáng)性目標(biāo)平均光密度值，每張切片取平均值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，行方差分析、q檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析法。

2結(jié)果

2.1各組血漿CK、CK-MB含量的變化肢體I/R 2 h組與對(duì)照組比較，血漿CK和CK-MB含量分別升高了61.1%和128.6%(P<0.01)；肢體I/R 4 h組與對(duì)照組比較，血漿CK和CK-MB含量進(jìn)一步升高，分別升高144.4%和246.4%(P<0.01)，見(jiàn)表1。

組別CK(μmol/L)CK-MB(μmol/L)對(duì)照組0.36±0.090.28±0.11I/R2h組0.58±0.081)0.64±0.101)I/R4h組0.88±0.101)0.97±0.101)

與對(duì)照組比較：1)P<0.01

2.2各組動(dòng)物心肌組織ROS、MDA、SOD含量變化肢體I/R 2 h組與對(duì)照組比較，心肌組織ROS和MDA含量分別升高了24.2%和25.7%(P<0.05)，SOD含量降低了12.4%(P<0.05)；肢體I/R 4 h組與對(duì)照組比較，心肌組織ROS和MDA含量分別升高了77.9%和48.3%(P<0.01)，SOD含量降低了21.6%(P<0.01)，見(jiàn)表2。

組別ROS(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)SOD(U/mgprot)對(duì)照組34.26±1.329.49±2.9171.55±6.21I/R2h組42.54±1.481)11.92±1.481)63.66±3.721)I/R4h組60.94±2.102)14.07±2.482)56.82±4.832)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01，下表同

2.3各組心肌凋亡細(xì)胞的變化TUNEL染色可見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞核呈棕黃色，形狀不規(guī)整；肢體I/R 2 h組與對(duì)照組比較，心肌組織可見(jiàn)凋亡細(xì)胞增多，AI升高，但無(wú)差異顯著性。肢體I/R 4 h組與對(duì)照組比較，心肌組織可見(jiàn)凋亡細(xì)胞顯著增多，AI升高(P<0.01)，見(jiàn)表3，圖1。

2.4心肌組織Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的檢測(cè)Bcl-2和Bax主要存在于心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)或胞膜呈棕黃色顆粒或勻質(zhì)狀。對(duì)照組呈弱陽(yáng)性表達(dá)，肢體I/R 2 h組與對(duì)照組比較，Bcl-2表達(dá)未見(jiàn)明顯變化，Bax表達(dá)上調(diào)，肢體I/R 4 h組與對(duì)照組比較，Bcl-2和Bax表達(dá)均明顯上調(diào)，Bcl-2/Bax比值降低(P<0.01)，見(jiàn)圖2、圖3、表3。

2.5相關(guān)分析結(jié)果肢體I/R組心肌組織中ROS含量與Bax蛋白表達(dá)平均吸光度值和AI之間呈顯著正相關(guān)(r=0.746，P<0.01；r=0.643，P<0.01)。

組別AI(%)Bcl-2BaxBcl-2/Bax對(duì)照組2.53±1.070.120±0.0070.112±0.0091.080±0.116I/R2h組4.45±1.670.126±0.0090.132±0.0121)0.955±0.0671)I/R4h組16.59±2.592)0.160±0.0082)0.172±0.0102)0.935±0.0512)

圖1　TUNEL法檢測(cè)各組大鼠心肌細(xì)胞的凋亡形態(tài)學(xué)改變(×400)

圖2　免疫組化法檢測(cè)各組大鼠心肌組織Bcl-2蛋白表達(dá)(DAB，×200)

圖3　免疫組化法檢測(cè)各組大鼠心肌組織Bax蛋白表達(dá)(DAB，×200)

3討論

嚴(yán)重的肢體I/R不僅局部經(jīng)歷缺血再灌注損傷，甚至可導(dǎo)致遠(yuǎn)隔器官心肌的損傷〔1〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨再灌時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠血漿心肌酶CK、CK-MB漏出增多。CK和CK-MB是催化心肌細(xì)胞代謝的重要酶類物質(zhì)，是檢測(cè)心肌損傷的特異性指標(biāo)。隨著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，心肌酶泄露增多，預(yù)示心肌發(fā)生了損傷。為證實(shí)再灌注心肌發(fā)生了何種損傷，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示細(xì)胞凋亡存在于LI/R后心肌損傷過(guò)程中。

研究證實(shí)ROS是誘導(dǎo)多種心血管疾病發(fā)生的重要機(jī)制，介導(dǎo)整個(gè)損傷過(guò)程〔6〕。ROS對(duì)細(xì)胞的主要損傷是造成脂質(zhì)過(guò)氧化，其代謝產(chǎn)物為MDA，間接反映組織細(xì)胞受ROS損傷的嚴(yán)重程度。SOD是體內(nèi)主要的氧自由基清除酶，其活性強(qiáng)弱反映自由基清除水平。ROS的過(guò)量生成和(或)細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)受損，導(dǎo)致ROS及其相關(guān)代謝產(chǎn)物過(guò)量聚集而引起的氧化應(yīng)激狀態(tài)，是肢體I/R后致遠(yuǎn)隔器官損傷的主要機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠肢體在恢復(fù)血流供給后，心肌組織ROS大量產(chǎn)生，自由基清除酶SOD含量降低，脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA水平明顯增高，證實(shí)心肌處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。Cook等〔7〕首先研究發(fā)現(xiàn)H2O2或O2·等外源性ROS可誘導(dǎo)培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡。研究表明，眾多上游應(yīng)激信號(hào)，包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等與心肌細(xì)胞凋亡信號(hào)有明顯的交聯(lián)〔8〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ROS增加與心肌組織細(xì)胞凋亡的增加相一致，說(shuō)明ROS是參與細(xì)胞凋亡的重要因素之一。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞主動(dòng)死亡的一種形式，主要受細(xì)胞內(nèi)凋亡調(diào)控蛋白的影響，促凋亡蛋白與抗凋亡蛋白間失衡所致。Bcl-2家族蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過(guò)程中起重要作用，Bcl-2是抑制細(xì)胞凋亡的基因，而B(niǎo)ax為Bcl-2的同源體，抑制Bcl-2作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔9，10〕。Bcl-2與Bax可以結(jié)合成雜二聚體，兩者比率決定細(xì)胞凋亡的敏感性，當(dāng)Bcl-2/Bax增加，抑制細(xì)胞凋亡，Bcl-2/Bax降低，促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔11〕。本研究表明Bcl-2和Bax表達(dá)的變化可能參與肢體I/R后心肌損傷，胞內(nèi)Bcl-2/Bax比值是影響心肌凋亡的重要因素之一。直線相關(guān)分析提示ROS增加可能通過(guò)Bcl-2/Bax信號(hào)途徑參與了心肌凋亡，氧化應(yīng)激源性激活的Bcl-2/Bax信號(hào)途徑在心肌損傷致心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。

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〔2014-09-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)

基金項(xiàng)目：唐山市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展項(xiàng)目(No.12130239b)

中圖分類號(hào)〔〕R363.2〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)23-6666-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.010