劉　云　李曉紅　朱洪竹　朱梅菊

(湖南工業(yè)大學(xué)體育學(xué)院，湖南　株洲　412000)

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力竭運(yùn)動(dòng)模型大鼠接受石菖蒲正丁醇提取物干預(yù)后紅細(xì)胞形態(tài)參數(shù)及免疫黏附變化

劉云李曉紅朱洪竹1朱梅菊1

(湖南工業(yè)大學(xué)體育學(xué)院，湖南株洲412000)

摘要〔〕目的 探討石菖蒲正丁醇提取物對(duì)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)大鼠紅細(xì)胞(RBC)形態(tài)參數(shù)、免疫功能及自由基代謝的影響。方法6周齡SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、單純運(yùn)動(dòng)組、石菖蒲正丁醇提取物組、人參提取物組(運(yùn)動(dòng)+人參提取物組)。所有運(yùn)動(dòng)大鼠進(jìn)行4 w的跑臺(tái)訓(xùn)練，最后一次進(jìn)行力竭跑臺(tái)。股動(dòng)脈采血測(cè)定RBC形態(tài)和相關(guān)參數(shù)、RBC超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量及RBC免疫黏附功能(RBC C3b受體花環(huán)率和RBC免疫復(fù)合物花環(huán)率)等指標(biāo)。結(jié)果實(shí)驗(yàn)4 w后，RBC、血紅蛋白、血細(xì)胞比容、RBC中SOD活性、RBC C3b受體花環(huán)率和RBC免疫復(fù)合物花環(huán)率值明顯高于單純運(yùn)動(dòng)組，而平均RBC體積、RBC體積分布寬度、RBC中MDA含量和畸形RBC百分率顯著低于單純運(yùn)動(dòng)組(P<0.01，P<0.05)。結(jié)論石菖蒲正丁醇提取物具有改善耐力運(yùn)動(dòng)引起的大鼠貧血狀態(tài)、減輕RBC損傷、提高耐力運(yùn)動(dòng)大鼠RBC抗氧化能力和免疫功能等作用。

關(guān)鍵詞〔〕石菖蒲；免疫功能

1井岡山大學(xué)體育學(xué)院

第一作者： 劉云(1970-)，男，博士，副教授，主要從事運(yùn)動(dòng)性疲勞與恢復(fù)方面的研究。

石菖蒲為歷代延年益智的要藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品，屬于增力類中藥之一〔1〕。研究表明，該藥具有明顯的抗腦缺氧和提高小鼠力竭游泳時(shí)間的作用〔2〕。本課題前期研究表明，石菖蒲提取物能明顯提高大強(qiáng)度訓(xùn)練小鼠的運(yùn)動(dòng)能力，使大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練小鼠體內(nèi)糖貯備顯著增加〔3〕，并顯示石菖蒲體內(nèi)抗運(yùn)動(dòng)性疲勞作用的活性部位主要集中在低極性的揮發(fā)油部分和極性較大的正丁醇及水部分〔4〕。人參是公認(rèn)的抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的中藥，本實(shí)驗(yàn)以人參提取物為陽(yáng)性對(duì)照，擬進(jìn)一步探討石菖蒲正丁醇提取物對(duì)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)大鼠紅細(xì)胞(RBC)形態(tài)和形態(tài)參數(shù)、免疫功能及自由基代謝的影響。

1材料與方法

1.1材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)健康雄性SD大鼠40只，鼠齡6 w，體質(zhì)量(275.00±27.65)g，由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：粵檢證字99A053號(hào)。所有的實(shí)驗(yàn)程序遵守廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定。大鼠飼養(yǎng)的環(huán)境溫度25℃～26℃，濕度40%，光照12 h；自由飲食和飲水。石菖蒲正丁醇提取物按文獻(xiàn)〔4〕方法制備。從昆明市藥材局購(gòu)買(mǎi)大理產(chǎn)石菖蒲1 kg，首先運(yùn)用水蒸氣蒸餾法提取石菖蒲中揮發(fā)油，再用95%的乙醇熱提3次，減壓濃縮成浸膏，殘?jiān)儆盟逯?次，在60℃的水浴中濃縮成浸膏，依次得揮發(fā)油、乙醇提取物和水煎液。對(duì)乙醇提取物再依次用乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行萃取，分別減壓濃縮成浸膏，得乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和正丁醇萃余物。將正丁醇提取物放4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

人參提取物的提取按文獻(xiàn)〔5〕方法進(jìn)行。從昆明市藥材局購(gòu)買(mǎi)人參100 g，首先運(yùn)用石油醚分別熱提3次，減壓濃縮成浸膏；其殘?jiān)扔皿w積分?jǐn)?shù)95%的乙醇分別熱提3次，減壓濃縮成浸膏；然后再用水煎煮3次，在60℃的水浴中濃縮成浸膏。最后將此三者合并成混合提取物，放4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組，單純運(yùn)動(dòng)組，人參提取物組和石菖蒲正丁醇提取物組，各10只。各組大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲食，室溫22℃～24℃。

1.2.1跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)除正常對(duì)照組不進(jìn)行任何運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練外，各組動(dòng)物在小動(dòng)物跑臺(tái)(天津運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所研制)上進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練，訓(xùn)練方案參照汶希等〔6〕介紹的大鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞模型的建立。坡度為0°，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案見(jiàn)表1，7次/w，連續(xù)4 w。第4周末除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠均進(jìn)行一次性力竭跑臺(tái)訓(xùn)練。力竭標(biāo)準(zhǔn)為連續(xù)施加機(jī)械刺激大鼠不能繼續(xù)跑動(dòng)，下跑臺(tái)后腹部觸地，嚴(yán)重呈“甲魚(yú)狀”。

1.2.2藥物干預(yù)人參提取物和石菖蒲正丁醇提取物分別用生理鹽水制備成水溶液，使用灌胃法。藥物劑量換算參照文獻(xiàn)〔7〕。以人參提取物(0.29 g/kg)和石菖蒲正丁醇提取物(0.62 g/kg)分別灌胃人參提取物組和石菖蒲正丁醇提取物。正常對(duì)照組和單純運(yùn)動(dòng)組以等體積(2 ml)生理鹽水灌胃，每天跑臺(tái)訓(xùn)練前2 h灌胃1次。實(shí)驗(yàn)時(shí)間4 w。

1.2.3RBC參數(shù)的測(cè)定力竭大鼠休息24 h后用1%戊巴比妥麻醉，腹主動(dòng)脈采血，肝素抗凝，用日本產(chǎn)Symsex K-4500血細(xì)胞分析儀(Symsex Corporation，Kobe，日本)進(jìn)行測(cè)定。檢測(cè)項(xiàng)目：RBC數(shù)量、血紅蛋白含量、血細(xì)胞比容、平均RBC體積，平均RBC血紅蛋白含量和RBC體積分布寬度。

1.2.4RBC掃描電鏡標(biāo)本的制備將肝素抗凝血0.5 ml以1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入0.86%NaCl溶液洗滌，離心，棄上清，共3次。2.5%戊二醛固定，體積分?jǐn)?shù)95%乙醇梯度脫水，滴臺(tái)，CO2臨界點(diǎn)干燥，E-1010離子濺射儀(Philips Co.，Eindhoven，Netherlands)噴金，在PHILIPS XL30-EDAX掃描電子顯微鏡(Philips Co.，Eindhoven，Netherlands，日本)下進(jìn)行RBC形態(tài)觀察，每個(gè)樣本觀察1 000個(gè)RBC，參照潘力等〔8〕報(bào)道的RBC形態(tài)分類方法觀察RBC的形態(tài)，計(jì)算畸形RBC比例。

1.2.5RBC中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的測(cè)定SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法(測(cè)定。MDA含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定。蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定。SOD測(cè)試盒及MDA測(cè)試盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，所有操作均嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.6RBC補(bǔ)體3b(C3b)受體花環(huán)率和RBC免疫復(fù)合物花環(huán)率的檢測(cè)按照郭峰等〔9〕建立的RBC C3b受體花環(huán)和免疫復(fù)合物花環(huán)實(shí)驗(yàn)，分別測(cè)定RBC C3b受體花環(huán)率和RBC免疫復(fù)合物花環(huán)率。以RBC黏附2個(gè)以上(含2個(gè))酵母多糖為一朵花環(huán)，均衡計(jì)數(shù)200個(gè)RBC，計(jì)算出花環(huán)率。酵母多糖凍干試劑由第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院血液免疫室提供。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

表1大鼠運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案(m/min×min)

周次星期一星期二星期三星期四星期五星期六星期日第一周15×1515×1518×2018×2020×2520×2520×25第二周22×2522×2523×3023×3024×3024×3024×30第三周25×3025×3026×3026×3026×3026×3026×30第四周27×3127×3227×3227×3228×3228×3228×32

2結(jié)果

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中除正常對(duì)照組外，其余各組均死亡2只。

2.1石菖蒲正丁醇提取物對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠RBC參數(shù)的影響與正常對(duì)照組相比，單純運(yùn)動(dòng)組大鼠RBC數(shù)量、血紅蛋白含量、血細(xì)胞比容和平均RBC血紅蛋白含量明顯降低(P<0.01)，而平均RBC體積和RBC體積分布寬度顯著增加(P<0.01)；與單純運(yùn)動(dòng)組相比，石菖蒲正丁醇提取物組和人參提取物組大鼠RBC數(shù)量、血紅蛋白含量、血細(xì)胞比容和平均RBC血紅蛋白含量增加(P<0.01，P<0.05)，而平均RBC體積和RBC體積分布寬度減少(P<0.01)；且石菖蒲正丁醇提取物組大鼠血細(xì)胞比容低于人參提取物組(P<0.05)，平均RBC體積和RBC體積分布寬度高于人參提取物組(P<0.01，P<0.05)。見(jiàn)表2，圖1。

組別nRBC數(shù)量(×1012/L)血紅蛋白(g/L)血細(xì)胞比容(%)平均RBC體積(fl)平均RBC血紅蛋白(pg)RBC體積分布寬度(%)正常對(duì)照組109.56±0.32143.90±5.450.52±0.0650.20±1.9315.16±0.658.88±0.55單純運(yùn)動(dòng)組87.83±0.922)107.80±15.732)0.32±0.042)62.60±6.522)11.37±0.882)13.16±0.952)石菖蒲正丁醇提取物組88.93±0.441)4)120.90±14.782)3)0.38±0.052)4)5)56.20±4.591)4)5)13.41±0.751)4)10.59±0.832)4)6)人參提取物組89.22±0.394)129.10±11.194)0.43±0.052)4)51.70±3.494)13.64±0.764)9.50±0.454)

與正常對(duì)照組相比：1)P<0.05，2)P<0.01；與單純運(yùn)動(dòng)組相比：3)P<0.05，4)P<0.01；與人參提取物組相比：5)P<0.05，6)P<0.01

A，E為正常對(duì)照組；B，F(xiàn)為單純運(yùn)動(dòng)組；C，G為石菖蒲正丁醇提取物組；D，H為人參提取物組；A～D為×8 000，E～H為×3 000 圖1　大鼠外周血RBC形態(tài)

2.2石菖蒲正丁醇提取物對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠RBC形態(tài)的影響與正常對(duì)照組〔(11.80±3.30)%〕相比，單純運(yùn)動(dòng)組大鼠外周血RBC畸形率〔(41.60±7.40)%〕顯著上升(P<0.01)；而與單純運(yùn)動(dòng)組相比，石菖蒲正丁醇提取物組〔(28.90±7.80)%〕和人參提取物組〔(20.80±8.90)%〕大鼠外周血RBC畸形率明顯下降(P<0.01)；且石菖蒲正丁醇提取物組大鼠外周血RBC畸形率高于人參提取物組(P<0.05)。

2.3石菖蒲正丁醇提取物對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠RBC免疫黏附功能的影響與正常對(duì)照組比較，單純運(yùn)動(dòng)組大鼠RBC C3b受體花環(huán)率值和RBC免疫復(fù)合物花環(huán)率值顯著降低(P<0.01)。與單純運(yùn)動(dòng)組比較，石菖蒲正丁醇提取物組和人參提取物組大鼠RBC C3b受體花環(huán)率和RBC免疫復(fù)合物花環(huán)率值明顯升高(均P<0.01)，但石菖蒲正丁醇提取物組和人參提取物組間RBC C3b受體花環(huán)率比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)；石菖蒲正丁醇提取物組和人參提取物組間RBC免疫復(fù)合物花環(huán)率低于人參提取物組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.4石菖蒲正丁醇提取物對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠RBC自由基代謝的影響與正常對(duì)照組比較，單純運(yùn)動(dòng)組大鼠RBC SOD酶活性明顯降低，MDA水平顯著升高(P<0.01)。與單純運(yùn)動(dòng)組比較，石菖蒲正丁醇提取物組和人參提取物組大鼠RBC SOD酶活性明顯升高，MDA水平明顯降低(均P<0.01)。石菖蒲正丁醇提取物組大鼠RBC SOD酶活性低于人參提取物組，MDA水平高于人參提取物組(均P<0.01)。見(jiàn)表3。

組別nSOD(U/ml)MDA(nmol/ml)RBCC3b受體花環(huán)率(%)RBC免疫復(fù)合物花環(huán)率(%)正常對(duì)照組10141.10±12.401.33±0.0812.10±1.6725.90±1.97單純運(yùn)動(dòng)組896.30±12.891)3.45±0.341)8.90±1.191)16.90±1.671)石菖蒲正丁醇提取物組8110.50±15.721)2)4)2.56±0.201)2)4)15.10±1.191)2)25.00±2.002)3)人參提取物組8134.30±15.741)2)1.95±0.161)2)15.00±1.831)2)26.80±1.932)

與正常對(duì)照組相比：1)P<0.01；與單純運(yùn)動(dòng)組相比：2)P<0.01；與人參提取物組相比：3)P<0.05，4)P<0.01

3討論

RBC是人體血液中的主要有形成分，在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中它是決定運(yùn)動(dòng)員最大攝氧量的主要因素。血紅蛋白的主要作用是運(yùn)輸氧氣，供組織利用，因此它是公認(rèn)的監(jiān)測(cè)機(jī)體耐力運(yùn)動(dòng)能力的主要指標(biāo)之一〔10〕。但是血紅蛋白只有存在于RBC內(nèi)才能發(fā)揮作用，如果RBC被破壞，血紅蛋白也就喪失其作用，一旦RBC受到損害，RBC的運(yùn)氧能力下降，機(jī)體容易產(chǎn)生疲勞，嚴(yán)重影響運(yùn)動(dòng)能力。RBC、血紅蛋白、血細(xì)胞比容是醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的診斷貧血的重要標(biāo)準(zhǔn)之一〔11〕。平均RBC體積和RBC體積分布寬度是國(guó)內(nèi)外作為觀察RBC形態(tài)的重要指標(biāo)，能準(zhǔn)確反映RBC的變形及損傷程度〔12〕。本實(shí)驗(yàn)提示通過(guò)5 w遞增大強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)大鼠出現(xiàn)了較明顯的貧血，并推測(cè)這種貧血不是由機(jī)體血漿體積適應(yīng)性擴(kuò)增引起的，而是由于遞增大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練造成RBC損傷所致〔13〕。RBC的掃描電鏡觀察結(jié)果也支持這種觀點(diǎn)。石菖蒲正丁醇提取物可能通過(guò)抵抗運(yùn)動(dòng)造成的RBC損傷，改善由于長(zhǎng)時(shí)間遞增大強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)所致的貧血狀態(tài)。

眾多研究表明氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致RBC的損傷〔14〕。RBC MDA含量的增加不僅會(huì)導(dǎo)致RBC膜的脂質(zhì)過(guò)氧化，既而造成RBC的損傷，而且還會(huì)修飾RBC膜蛋白，如膜收縮蛋白(spectrins)和帶3(band 3)蛋白，而引起RBC的損傷〔15〕。研究表明大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以導(dǎo)致RBC和白細(xì)胞的氧化應(yīng)激，高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練使身體持續(xù)置于高水平的氧化應(yīng)激之中，從而造成RBC的氧化損傷〔16〕。本項(xiàng)研究提示遞增大強(qiáng)度跑臺(tái)訓(xùn)練大鼠RBC出現(xiàn)了較明顯的氧化應(yīng)激損傷。石菖蒲正丁醇提取物可通過(guò)提高RBC SOD酶活性，降低RBC中MDA含量，從而減輕遞增大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練引起的RBC氧化損傷。

運(yùn)動(dòng)對(duì)RBC免疫功能的影響及其調(diào)控是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)界較新的研究領(lǐng)域。人體大約有95%的循環(huán)C3b受體存在于RBC中表面，RBC膜上的C3b受體能夠黏附抗原-抗體-補(bǔ)體復(fù)合物，并將其攜帶至肝、脾被吞噬細(xì)胞吞噬清除〔17〕，是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分。研究表明大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練后小鼠RBC C3b受體活性降低，RBC黏附循環(huán)免疫復(fù)合物的能力降低〔18〕。實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦提示大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練能導(dǎo)致RBC免疫功能降低，推測(cè)這可能與大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練引起RBC的氧化損傷，破壞了RBC的正常形態(tài)等有關(guān)〔19〕。石菖蒲正丁醇提取物能減輕耐力訓(xùn)練引起的RBC氧化損傷，使更多的RBC具有正常的形態(tài)和功能，RBC黏附循環(huán)免疫復(fù)合物的能力提高，以促使耐力訓(xùn)練所致的RBC免疫功能降低得到改善。因此，石菖蒲正丁醇提取物組RBC C3b受體活性和RBC黏附循環(huán)免疫復(fù)合物的能力顯著高于單純運(yùn)動(dòng)組。

石菖蒲為天南星科菖蒲屬植物石菖蒲的干燥根莖，是歷代延年、益智的要藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品，屬于增力類中藥之一。研究表明，該藥具有明顯的抗腦缺氧和提高小鼠力竭游泳時(shí)間的作用〔2，3〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明石菖蒲提取物不但能提高小鼠的運(yùn)動(dòng)能力，而且能有效地改善運(yùn)動(dòng)引起的貧血狀態(tài)〔20〕，并提示石菖蒲改善機(jī)體貧血狀態(tài)的有效部位可能主要集中在其正丁醇部分。5-羥甲基糠醛是石菖蒲正丁醇提取物中含量較大的活性成分，不但具有較強(qiáng)的抗氧化能力，而且還能顯著促進(jìn)RBC的代謝，抵抗由過(guò)氧化氫介導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷〔21〕。因此推測(cè)石菖蒲正丁醇提取物提高大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練大鼠RBC的抗氧化能力、保護(hù)RBC、改善大鼠的貧血狀態(tài)可能與5-羥甲基糠醛等有關(guān)，這有待進(jìn)一步研究。

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〔2015-06-17修回〕

(編輯袁左鳴)

The effects of n-BuOH extracts from Acorus Tatarinowii Schott on morphology parameters, antioxidation and immunity capacity of erythrocytes in exhaustion exercised rats

LIU Yun, LI Xiao-Hong，ZHU Hong-Zhu,etal.

Institute of PE,Hunan University of Technology, Zhuzhou 412000, Hunan, China

【Abstract】ObjectiveTo study the effects of n-BuOH extracts from Acorus tatarinowii Schott on morphology，morphological indexes, antioxidation and immunity capacity of erythrocytes in exercised rats.MethodsThe six-week old rats were divided randomly into normal, exercise, exercise+Ginseng extract(serving as positive control group), exercise+ n-BuOH extracts from Acorus tatarinowii Schott groups. The exercised rats had treadmill running for 4 weeks, and at the last time they run exhaustively. The morphology and morphological indexes of erythrocyte, function of erythrocyte immune and antioxidation were tested after treadmill running exhaustively.Resultsn-BuOH extracts from Acorus tatarinowii Schott increased the counts of RBC, the contents of Hb, the value of HCT, the percentage of RBC-C3bR and RBC-ICR and the activity of RBC-SOD ，decreasing the value of MCV and RDW, RBC-MDA contents and the percentage of misshapen RBCs compared to those of exercised group (P<0.01，P<0.05).Conclusionsn-BuOH extracts from Acorus tatarinowii Schott are effective on ameliorating anemia, protecting morphological integrity of erythrocyte from injury by endurance exercise and improving antioxidation and immunity capacity of erythrocytes in rats by endurance exercise.

【Key words】Acorus tatarinowii Schott; Immunity function

通訊作者：李曉紅(1974-)，女，講師，碩士，主要從事學(xué)校體育學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160217, 31360255)；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(10152404801000008)

中圖分類號(hào)〔〕R28〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)23-6662-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.009