陳怡河南師范大學(xué)
高通量測序技術(shù)及其發(fā)展
陳怡
河南師范大學(xué)
摘要:高通量測序技術(shù)是DNA測序的革命性技術(shù)創(chuàng)新,具有同時對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行測序和一般的讀長較短的功能。速度快、準(zhǔn)確率高、成本低,實現(xiàn)了對物種基因組或轉(zhuǎn)錄組的深入研究。該文詳細介紹了高通量測序技術(shù)的種類和測序原理,以及各種測序平臺的發(fā)展進程和優(yōu)缺點。
關(guān)鍵詞:高通量測序技術(shù);454焦磷酸測序;Solexa測序;SOL?ID測序;第三代測序技術(shù)
自1975年Frederick Sanger和Walter Gilbert創(chuàng)建DNA測序技術(shù)以來,DNA測序飛躍發(fā)展,成為分子生物學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的重要研究技術(shù)。Sanger測序法在測序量和微量化等方面具有一定的局限性。高通量測序與單分子測序技術(shù)相繼涌現(xiàn),為大規(guī)模測序提供了技術(shù)支持。
高通量測序技術(shù)運行數(shù)據(jù)量大,可以同時對數(shù)百萬個DNA分子實施序列檢測。高通量測序平臺主要包括Roche公司/454焦磷酸測序、Illumina公司/Solexa聚合酶合成測序及ABI公司/SOLID連接酶測序。
以Roche/454焦磷酸測序為例,該技術(shù)的檢測原理為,第一步把DNA單鏈運用PCR進行擴增與引物雜交,雜交后產(chǎn)物與ATP硫酸化酶、DNA聚合酶、熒光素酶及5’磷酸硫腺苷一起反應(yīng)孵育。此過程中dNTP會依次加入到引物上。加入的dNTP若與模板配對便釋放相同數(shù)量的焦磷酸基團。ATP硫酸化酶催化焦磷酸基團生成ATP,ATP驅(qū)動熒光素酶催化熒光素向氧化熒光素轉(zhuǎn)化并發(fā)出與ATP含量成線性關(guān)系的可見光信號。之后ATP與未反應(yīng)的dNTP及時被降解。再生的反應(yīng)體系進入到下一種dNTP循環(huán),根據(jù)所得信號峰值圖可獲得DNA序列信號。此技術(shù)讀取長度最長,但通量最低。當(dāng)測序遇到多聚核苷酸時(如AAAAAA)時,堿基個數(shù)與熒光信號強度不再成線性關(guān)系,所以在檢測具有重復(fù)序列的DNA片段時具有困難。454焦磷酸測序法常用的平臺為GS FLX Titanium sequencing Kit XL+。
Solexa聚合酶合成測序技術(shù)讀取的片段多,測序通量高,高度自動化,適合大量小片段DNA的測序。但可逆反應(yīng)時隨反應(yīng)次數(shù)的增加效率降低、信號減弱,且讀長短,從頭測序具有困難。該技術(shù)廣泛應(yīng)用的測序平臺為MiSeq。
SOLiD連接酶測序每個堿基讀取兩次,準(zhǔn)確性較高,特別是針對SNP的檢測,適合檢測參考基因序列。在三種測序技術(shù)中,該技術(shù)測序讀長為50bp最短,讀取長度受反應(yīng)次數(shù)限制。ABI 3730 XL等測序平臺被廣泛應(yīng)用。
第三代測序技術(shù)指Pacific Bioscience公司的單分子實時測序技術(shù)(SMRT),Helico BioScience公司單分子測序技術(shù)(TIRM),以及Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子測序技術(shù)。新一代測序技術(shù)達到長讀取長度、高通量、低成本的目的。不同于第二代測序,第三代分子測序不需進行PCR擴增,DNA模板與固體表面結(jié)合后邊合成邊測序。
2.1Pacific Bioscience SMRT技術(shù)
Pacific Bioscience公司的SMRT技術(shù)基于邊合成邊測序的原理,采用Zero-ModeWaveguide(ZMW零級波導(dǎo))。測序過程為:被熒光標(biāo)記的核苷酸與模板鏈結(jié)合在聚合酶活性位點上(每種脫氧核苷酸由不同顏色染料標(biāo)記),激發(fā)出不同熒光,在熒光脈沖結(jié)束后,被標(biāo)記的磷酸集團被切割釋放,聚合酶轉(zhuǎn)移到下一個位點,下一個脫氧核苷酸連接到位點上進行熒光脈沖,進入下一測序過程。
2.2Helico BioScience TIRM技術(shù)
Helico BioScience公司的基于全內(nèi)反射顯微鏡的測序技術(shù)——單分子測序技術(shù)(TIRM)同樣利用邊合成邊測序的原理,隨機打斷待測序列成小分子片段,用末端轉(zhuǎn)移酶在小片段的3’末端添加poly(A),在poly(A)末端實施阻斷及熒光標(biāo)記,將小片段與帶有poly(T)的平板雜交,加入聚合酶和被熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸進行DNA合成,每循環(huán)一次加入一種dNTP,之后洗脫去除未合成的DNA聚合酶和dNTP,對Cy3成像,檢測模板位點上的熒光信號,對核苷酸上的染料裂解釋放,加入下一種dNTP和聚合酶,進行下一輪循環(huán)。
2.3Oxford Nanopore Technologies納米孔單分子測序技術(shù)
納米孔測序技術(shù)的原理不同與前兩種技術(shù),DNA分子或其堿基從孔洞經(jīng)過時會影響固有光信號和電流。OxfordNanopore納米孔單分子測序技術(shù)采用α—溶血素構(gòu)建孔洞,核酸外切酶黏附在孔洞外表面,傳感器(環(huán)糊精)結(jié)合到孔洞的內(nèi)表面。之后脂雙分子層包裹納米孔。脂雙分子層兩側(cè)為不同鹽濃度,并提供合適的物理條件。在合適電壓下,核酸外切酶催化斷裂DNA單鏈,堿基進入納米孔中,與孔內(nèi)的環(huán)糊精反應(yīng),影響流過納米孔的固有電流,每個堿基都能產(chǎn)生特定電流,運用該方法可將不同堿基區(qū)分開來。
近年間,高通量測序被廣泛應(yīng)用到各領(lǐng)域,新一代測序技術(shù)也取得突飛猛進的進展,但后續(xù)的海量測序數(shù)據(jù)分析,以及如何以生物知識去解釋和應(yīng)用都存在問題。但總體上,新一代測序技術(shù)的費用已大大降低,具有精確度高、速度快、敏感性強等顯著特點。隨著高通量測序技術(shù)的飛躍發(fā)展,相信在不久的將來,測序技術(shù)會在生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮更加重要的作用。
參考文獻:
[1]岳桂東,高強,羅海龍,等.高通量測序技術(shù)在動植物研究領(lǐng)域中的應(yīng)用[J].中國科學(xué),2012,42(2):107-124.
[2]王興春,楊致榮,王敏,等.高通量測序技術(shù)及其應(yīng)用[J].中國生物工程,2012,32(1):109-114.
[3]劉莉揚,張學(xué)工.高通量測序技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用進展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2013,19(16):2971-2973.
作者簡介:陳怡(1995-),女,漢,本科,河南省永城人,河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。