林峰　梁帥強　周玲等

摘要：收集具有豐富遺傳多樣性的種質(zhì)資源是玉米育種的前提，通過對資源進行雜種優(yōu)勢群的劃分可以顯著提高育種效率。本研究利用135對InDel分布在玉米10條染色體上的分子標(biāo)記引物，系統(tǒng)分析了491份玉米自交系的遺傳多樣性，結(jié)果顯示標(biāo)記多態(tài)性信息量變化范圍為0.255～0.678。通過計算遺傳相似值（GS），上述材料被劃分成8個包括Reid群、Lancaster群、四平頭群和PB群的雜種優(yōu)勢群。本研究結(jié)果為組配優(yōu)良玉米雜交種提供了遺傳信息。

關(guān)鍵詞：玉米；分子標(biāo)記；遺傳多樣性；雜種優(yōu)勢群；遺傳相似性；InDel標(biāo)記

中圖分類號： S513.03文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0107-03

收稿日期：2015-08-24

基金項目：江蘇省自然科學(xué)基金（編號：BK20141385）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（13）3060]。

作者簡介：林峰（1978—），男，博士，助理研究員，主要從事遺傳育種研究。E-mail：flinlc@hotmail.com。

通信作者：趙涵，博士，研究員，主要從事作物遺傳育種研究。Tel：（025）84390751；E-mail：zhaohan@jaas.ac.cn。雜種優(yōu)勢是指2個遺傳組成不同的生物體雜交后的雜種一代在生長勢、生活力、抗逆性、產(chǎn)量及品質(zhì)等方面優(yōu)于雙親的現(xiàn)象。利用雜種優(yōu)勢獲得總體性狀優(yōu)于親本的雜交種是現(xiàn)代育種的重要手段之一。而雜種優(yōu)勢群集中了大量有利基因，群間自交系雜交時往往可以獲得較大的雜種優(yōu)勢。因此，雜種優(yōu)勢群的劃分有助于自交系改良和雜交種選配，對雜交育種具有重要意義。

玉米是典型的異交作物，雜種優(yōu)勢明顯。玉米中最早的一對雜種優(yōu)勢模式是Reid×Lancaster，2003年，Hallauer提出了BSSS-Tuxpeno和non-BSSS-non-Tuxpeno兩個雜種優(yōu)勢列（Heterotic Alignment）的概念，又稱SS和NSS群[1]，這一模式大大促進了玉米種質(zhì)的擴增、改良和創(chuàng)新，得到了廣泛應(yīng)用。根據(jù)系譜關(guān)系和配合力等，王懿波等將我國玉米主要種質(zhì)劃分為五大雜種優(yōu)勢群：改良Reid、Lancaster、四平頭、旅大紅骨以及其他雜種優(yōu)勢群[2]。分子標(biāo)記的發(fā)展為玉米雜種優(yōu)勢群的劃分提供了新的工具。利用RFLP和SSR標(biāo)記，袁力行等將供試材料劃分為四平頭、旅大紅骨、LSC、BSSS和PA等5個類群，劃分結(jié)果與系譜分析基本一致[3]。利用SSR標(biāo)記對玉米自交系進行分析，大多將其劃分為6～8個雜種優(yōu)勢群[4-6]。

InDel標(biāo)記是新一代共顯性遺傳標(biāo)記，具有數(shù)量多、擴增產(chǎn)物穩(wěn)定和易于檢測等優(yōu)點。本研究利用筆者所在研究室開發(fā)的135個InDel標(biāo)記分析了491份玉米自交系的遺傳多樣性，并進行了雜種優(yōu)勢群劃分，以期為這些材料的高效利用提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試材料

所用材料為491份玉米自交系，包括X178、Q319、P138、昌7-2、黃早四、Mo17、B73、鄭58等標(biāo)準(zhǔn)測驗種。2014年種植于南京市蔬菜科學(xué)研究所試驗地，每株系種植1行，行長 2 m，行寬40 cm，每行播種10粒。

1.2玉米InDel的發(fā)掘與標(biāo)記開發(fā)

根據(jù)Romay等開發(fā)的SNP標(biāo)記[7]，在多態(tài)位點附近與玉米B73基因組序列（v3）比對，利用Primer3[8]設(shè)計引物。通過電子PCR的策略在Mo17、B73、鄭58、昌7-2間進行模擬PCR擴增，進一步通過cPCR軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/e-pcr/）分析標(biāo)記位點的多態(tài)性，模擬中堿基錯配值Mismatch≤3 bp，電子多態(tài)性篩選的候選多態(tài)性位點即可能存在1個InDel[9]。利用該引物即可作為InDel標(biāo)記用于該位點的基因型檢測。

1.3基因型檢測

將所有自交系單株取樣，植物葉片用低溫真空干燥儀干燥后，采用Karroten植物基因組DNA提取試劑盒抽提DNA，具體步驟詳見試劑盒說明書。DNA加適量TE溶解后，4 ℃或-20 ℃貯藏待用。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包含5 pmol兩側(cè)引物，2.5 μL 10×buffer，1.25 nmol dNTP，1 U Taq聚合酶和40 ng模板DNA。擴增程序為94 ℃預(yù)變性3 min，然后進入擴增循環(huán)：94 ℃ 30 s，55 ℃或60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個循環(huán)；72 ℃反應(yīng)5 min。擴增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳分離，溴化乙錠顯色，凝膠成像儀上觀察、照相并記錄。

1.4聚類分析

篩選擴增單一條帶的引物對491份玉米材料進行檢測，比較不同材料里面的帶型差異。InDel標(biāo)記位點的多態(tài)性信息量（polymorphism information content，PIC）利用公式PIC=1-∑P2i 計算，Pi為i位點的基因頻率。自交系的遺傳相似值（genetic similarity，GS）由簡單相配系數(shù)（simple matching coefficient，SM）計算：GS=m/（m+n），m表示基因型間共有條帶的數(shù)目，n表示基因型間有差異的條帶數(shù)目。利用Tassel 5.0軟件（www.maizegenetics.net/tassel），根據(jù)自交系標(biāo)記遺傳相似矩陣，通過UPGMA（unweighted pair group method）方法進行遺傳距離聚類分析。

2結(jié)果與分析

2.1InDel的發(fā)掘及多態(tài)性分子標(biāo)記的開發(fā)

根據(jù)B73和Mo17的測序信息，共開發(fā)135對引物，分別位于玉米的10條染色體上，平均每條染色體12.2個標(biāo)記（圖1）。這些標(biāo)記在491份玉米材料中的多態(tài)性信息量變化范圍為0.255～0.678，平均0.489，其中ID196最大，HG20最?。ū?）。

2.2遺傳變異分析及聚類分析

使用135個InDel標(biāo)記計算491份玉米自交系之間的遺傳相似系數(shù)，其范圍在0.004～0.967之間，平均為0.469。根據(jù)491份玉米自交系材料的遺傳相似系數(shù)矩陣，利用UPGMA 方法對上述材料進行聚類分析，將491份材料分為8個大群（圖2）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)測驗種所代表的中國玉米生產(chǎn)上主要應(yīng)用的雜種優(yōu)勢群，在聚類分析劃分的群中包括Reid群（B73）、Lancaster群（Mo17）、四平頭群（昌7-2，黃早四）、PB

群（X178，Q319，P138）。

3結(jié)論與討論

玉米種質(zhì)資源是育種的前提，了解其親緣關(guān)系、劃分雜種優(yōu)勢群有助于自交系的改良和雜交種選配，能夠大大減少育種的盲目性。雜種優(yōu)勢群的劃分一般通過系譜法、表型聚類、同工酶以及分子標(biāo)記等方法。隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)得到廣泛應(yīng)用。

InDel標(biāo)記是指由于核苷酸插入或缺失引起的多態(tài)性標(biāo)記。通過重測序比較發(fā)現(xiàn)，玉米不同基因型間存在著大量 InDel 變異。Lai等分析了6個中國玉米優(yōu)良自交系，估算大約存在30 178個InDel，其中571個InDel位于功能基因內(nèi)[10]。這些變異導(dǎo)致了玉米的多樣性，并提供了更多的標(biāo)記位點。呂遠(yuǎn)大等利用玉米基因組重測序信息，建立了大規(guī)模開發(fā)分子標(biāo)記并對其進行電子多態(tài)性篩選的流程[9]。根據(jù)測序信息，筆者共開發(fā)出135對InDel標(biāo)記引物，這些標(biāo)記在491份玉米材料中的多態(tài)性信息量變化范圍為0.255～0678，可以用于分析不同玉米材料的遺傳多樣性。

通過系譜或SSR標(biāo)記分析，我國玉米主要種質(zhì)可劃分為6～8個雜種優(yōu)勢群[2-3]。利用InDel分子標(biāo)記對491份材料進行分析后，筆者得到的分群結(jié)果與上述結(jié)果一致。主要將491份材料分為8個大群，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)測驗種所代表的中國玉米生產(chǎn)上主要應(yīng)用的雜種優(yōu)勢群，筆者在聚類分析劃分的群中包括Reid群、Lancaster群、四平頭群和PB群，以及一些不清楚系譜來源的材料組成的亞群。對于新劃入群的材料可以根據(jù)所在雜種優(yōu)勢群進行有選擇的交配組合。

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