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2種表型試驗檢測葡萄球菌誘導(dǎo)型克林霉素耐藥的評估及基因分析

葡萄球菌屬中所有的菌種都有較大的潛在致病性，已成為臨床抗感染治療的一大難題[1-2]。1968年有學(xué)者報道2例耐紅霉素金黃色葡萄球菌引起的感染，治療前對克林霉素和林可霉素均敏感，但治療后林可霉素卻變?yōu)槟退?，于是作者推測克林霉素和林可霉素治療此類菌可能會引起治療無效[3]。大環(huán)內(nèi)酯類(如紅霉素)-林可酰胺類(如克林霉素)-鏈陽霉素B類復(fù)合藥物(macrolide-lincosamide-streptogramin B，MLS)為治療葡萄球菌感染的常用藥物[4]，在多數(shù)菌屬中，紅霉素一直是較強的誘導(dǎo)劑，具有誘導(dǎo)克林霉素耐藥的作用。因此，如何合理使用MLS已經(jīng)成為人們關(guān)注的焦點[5]。為此，實驗室有必要開展試驗對克林霉素誘導(dǎo)耐藥的菌株進行檢測并報告臨床。為評價MicroScan革蘭陽性復(fù)合板(簡稱PC33復(fù)合板)檢測葡萄球菌屬誘導(dǎo)型克林霉素耐藥的性能，本研究對醫(yī)院分離到的紅霉素耐藥而克林霉素敏感的葡萄球菌以D試驗(雙紙片法檢測克林霉素誘導(dǎo)耐藥試驗)為判斷標(biāo)準(zhǔn)，用PC33復(fù)合板進行誘導(dǎo)型克林霉素耐藥檢測，同時通過聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)進一步了解其基因分布情況。

材料和方法

一、材料

1.菌株來源復(fù)蘇同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院2013年6月至2014年6月PC33復(fù)合板結(jié)果為紅霉素耐藥而克林霉素敏感的葡萄球菌(使用Walkaway 96 plus全自動微生物鑒定和藥物敏感性分析儀)共115株，其中金黃色葡萄球菌31株、凝固酶陰性葡萄球菌84株。從同一患者同一部位多次分離的相同菌株按1次統(tǒng)計。菌株均來自同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院住院和門診患者送檢的樣本,包括痰液、咽拭子、尿液、膿液、分泌物、血液、透析液等。質(zhì)控菌株：金黃色葡萄球菌(ATCC 29213)作為PC33復(fù)合板的質(zhì)控菌株，金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)作為紙片擴散法藥物敏感性試驗的質(zhì)控菌株。

2.培養(yǎng)基及藥物敏感性紙片水解酪蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基為上海伊華生物公司產(chǎn)品；紅霉素(15 μg/片)、克林霉素(2 μg/片)為英國Oxoid公司產(chǎn)品。

3.試劑與儀器DNA抽提試劑盒及PCR試劑盒(TaKaRa公司)；2種耐藥基因的PCR引物(上海寶生物公司)；9700型基因擴增儀(美國MJRearch公司)；電泳儀(上海天能公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂公司)。

二、方法

1.菌株鑒定115株菌株用革蘭染色、凝固酶試驗、西門子Walkaway 96 plus全自動微生物鑒定和藥物敏感性分析儀及其配套的PC33復(fù)合板進行鑒定。

2.體外藥物敏感性分析采用PC33復(fù)合板聯(lián)合孔進行常規(guī)鑒定藥物敏感性分析，35 ℃培養(yǎng)16～18 h，觀察含紅霉素和克林霉素聯(lián)合孔(含4 μg/mL紅霉素和0.5 μg/mL克林霉素)是否有菌生長來判斷結(jié)果。

3.D試驗按照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標(biāo)準(zhǔn)進行操作和判讀[6]。挑選在35 ℃有氧環(huán)境孵育18～24 h的單個菌落，將0.5麥?zhǔn)蠁挝坏男迈r菌液均勻涂布于水解酪蛋白胨瓊脂平板，在相距15 mm處(邊緣到邊緣)分別貼上紅霉素(15 μg/片)和克林霉素(2 μg/片)紙片。35 ℃有氧環(huán)境孵育18～24 h后，按照紅霉素14～22 mm、克林霉素15～20 mm的標(biāo)準(zhǔn)判讀。

4.相關(guān)耐藥基因檢測(1)DNA抽提：所有試驗菌株經(jīng)DNA抽提試劑盒抽提后用PCR擴增試劑盒進行模板制備；(2)引物設(shè)計及PCR擴增：PCR引物參考文獻[7]，反應(yīng)過程見表1；(3)擴增產(chǎn)物分析：PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，100 V電泳45 min后紫外光線下觀察結(jié)果，置入凝膠成像儀中觀察并記錄結(jié)果。在預(yù)計位置420 和572 bp處出現(xiàn)條帶，分別為ermA、ermC基因。

表1　引物序列和PCR循環(huán)條件

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以百分率表示，2種方法的結(jié)果進行配對χ2檢驗，顯著性檢驗水準(zhǔn)α=0.05。同時以D試驗法為判斷標(biāo)準(zhǔn)評估PC33復(fù)合板檢測克林霉素誘導(dǎo)耐藥的敏感性及特異性。

結(jié)果

一、PC33復(fù)合板誘導(dǎo)孔結(jié)果及誘導(dǎo)耐藥的檢出率

含紅霉素和克林霉素聯(lián)合孔內(nèi)有菌生長為誘導(dǎo)試驗陽性，不生長為陰性。PC33復(fù)合板耐藥檢出率分別為金黃色葡萄球菌61.3%(19/31)、凝固酶陰性葡萄球菌47.6%(40/84)。見表2。

二、D試驗測定誘導(dǎo)耐藥表型結(jié)果及誘導(dǎo)耐藥的檢出率

當(dāng)克林霉素在靠近紅霉素紙片一側(cè)出現(xiàn)截平現(xiàn)象，即克林霉素紙片的抑菌環(huán)看似大寫的“D”時(稱為“D”抑菌環(huán))提示存在可誘導(dǎo)的克林霉素耐藥，為誘導(dǎo)型MLS(inducible macrolide-lincosamide-streptogramin B，iMLS )耐藥，即D試驗陽性；如果紅霉素和克林霉素均耐藥，則為結(jié)構(gòu)型MLS(constitutive macrolide-lincosamide-streptogramin B，cMLS)耐藥；如果克林霉素抑菌環(huán)仍為圓形，為MS表型，即D試驗陰性。見圖1。D試驗?zāi)退幍臋z出率分別為金黃色葡萄球菌61.3%(19/31)；凝固酶陰性葡萄球菌51.2%(43/84)。見表2。

三、PC33復(fù)合板與D試驗檢測克林霉素誘導(dǎo)耐藥的結(jié)果比較

經(jīng)配對χ2檢驗，2種方法的檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.5)，并以D試驗法為判斷標(biāo)準(zhǔn)評估PC33復(fù)合板檢測克林霉素誘導(dǎo)耐藥的敏感性為95.1%，特異性為100.0%；2種表型試驗金黃色葡萄球菌符合率為100.0%，凝固酶陰性葡萄球菌符合率為93.0%。見表2。在115株葡萄球菌中，D試驗結(jié)果和PC33復(fù)合板誘導(dǎo)孔結(jié)果同時陽性59株；D試驗結(jié)果陽性而PC33復(fù)合板誘導(dǎo)孔結(jié)果陰性3株；D試驗結(jié)果和PC33復(fù)合板誘導(dǎo)孔結(jié)果同時陰性53株(其中MS表型29株、cMLS 24株)。

四、erm基因在不同菌株中的分布

檢測ermA、ermC基因，發(fā)現(xiàn)cMLS耐藥菌株主要為ermA；iMLS耐藥菌株主要為ermC，見表3。PCR反應(yīng)產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳，見圖2、圖3。

表2　PC33復(fù)合板及D試驗?zāi)退帣z出率

注：(a)為cMLS型；(b)為iMLS型

圖1　克林霉素誘導(dǎo)試驗

注：1為DL2000 Marker; 2、3為陰性樣本；4~8為ermA基因陽性樣本

圖2ermA基因擴增片段電泳圖

注：1為DL2000 Marker； 2~8為ermC基因陽性樣本

圖3ermC基因擴增片段電泳圖

討論

臨床上葡萄球菌引起的醫(yī)院感染有所上升，而大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類等抗菌藥物由于其組織滲透性強、口服效果好且對腎臟無不良反應(yīng)等特點被應(yīng)用于治療該類細(xì)菌引起的感染[8]。在患者中發(fā)現(xiàn)，克林霉素耐藥情況是高度易變的，如果經(jīng)常使用，可造成iMLS的漏檢，導(dǎo)致臨床治療失敗，iMLS的耐藥表型是紅霉素耐藥而克林霉素敏感，必須用D試驗才能檢測出來[9]。應(yīng)用紅霉素和克林霉素紙片進行的D試驗首先由SWENSON等[10]倡導(dǎo)，該方法用于葡萄球菌屬克林霉素誘導(dǎo)耐藥的檢測，操作簡便，結(jié)果可靠。但紅霉素和克林霉素的紙片間距對試驗結(jié)果有較大影響[11]，2張紙片間距過大可導(dǎo)致假陰性[12]。由于D試驗是用紙片擴散法進行檢測，不適合臨床大量樣本作為常規(guī)藥物敏感性試驗。而PC33復(fù)合板克林霉素誘導(dǎo)孔使誘導(dǎo)型耐藥檢測實現(xiàn)自動化，簡單易行，準(zhǔn)確度高，本研究對其檢測性能進行了評估。115株試驗菌株中，D試驗陽性62株，D試驗?zāi)退帣z出率分別為金黃色葡萄球菌61.3%、凝固酶陰性葡萄球菌51.2%。PC33復(fù)合板檢測陽性59株，PC33復(fù)合板耐藥檢出率分別為金黃色葡萄球菌61.3%、凝固酶陰性葡萄球菌47.6%。本研究結(jié)果表明，以D試驗為判斷標(biāo)準(zhǔn)計算PC33復(fù)合板檢測克林霉素誘導(dǎo)耐藥的敏感性為95.1%，特異性為100.0%；2種表型試驗金黃色葡萄球菌符合率為100.0%，凝固酶陰性葡萄球菌符合率為93.0%。2種方法有很好的一致性，這與傅石明[13]的結(jié)果基本一致。在紙片法紅霉素與克林霉素同時耐藥的24例中，PC33復(fù)合板誘導(dǎo)孔未生長但紅霉素孔耐藥、克林霉素孔敏感，是否與PC33復(fù)合板對克林霉素的檢測能力不穩(wěn)定，或與操作人員處理菌液濃度是否均勻有關(guān)，有待進一步研究。

葡萄球菌對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥通常有2種機制：一是由msrA基因(僅影響大環(huán)內(nèi)酯類和鏈陽菌素B)或由mefA、mefE基因(僅影響大環(huán)內(nèi)酯類，不影響克林霉素和鏈陽菌素B)介導(dǎo)的主動流出的泵機制，編碼產(chǎn)生外排蛋白導(dǎo)致對大環(huán)內(nèi)酯類和鏈陽霉素B的耐藥，但對克林霉素敏感，這種耐藥表型稱為MS表型，即紅霉素耐藥而克林霉素敏感，這種能量依賴泵能在藥物與核糖體靶位結(jié)合前有效地從菌細(xì)胞內(nèi)排出大環(huán)內(nèi)酯類藥物。二是核糖體靶位改變，由各種erm基因編碼的核糖體甲基化酶所介導(dǎo)，核糖體上單個位點發(fā)生變化，23S rRNA 上腺嘌呤殘基N6 -二甲基化，導(dǎo)致核糖體構(gòu)象發(fā)生變化，表現(xiàn)為對大多數(shù)MLS抗菌藥物耐藥。這種耐藥體外可有2種表型，即cMLS和iMLS。若erm基因穩(wěn)定表達，則表現(xiàn)對紅霉素、克林霉素和其他MLS群成員耐藥，稱為MLS固有表型，即紅霉素耐藥且克林霉素耐藥，常規(guī)的體外藥物敏感性試驗均能測出。然而在某些情況下，基因需藥物誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)才能表達對克林霉素耐藥，否則體外可能會表現(xiàn)為對克林霉素敏感，紅霉素可作為這種誘導(dǎo)劑，這些分離菌在體外表現(xiàn)對紅霉素耐藥而對克林霉素敏感，稱為MLS誘導(dǎo)表型,即紅霉素耐藥而克林霉素敏感(誘導(dǎo)耐藥)。目前，在葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)了3種erm基因，即ermA、ermB和ermC，ermA和ermC比較常見，ermA+ermC是MLS葡萄球菌較為常見的復(fù)合基因型，而ermB較少見，主要從動物分離菌株中檢測到。本試驗對ermA、ermC進行了研究。

在115例試驗菌株中，29株MS表型的菌株未檢出任何基因型。12株iMLS耐藥的金黃色葡萄球菌菌株中，8株基因型為ermA，4株基因型為ermC，未檢出同時帶有2種基因的菌株；50株iMLS耐藥的凝固酶陰性葡萄球菌菌株中，11株基因型為ermA，38株基因型為ermC，1株檢出同時帶有2種基因的菌株。11株cMLS耐藥的金黃色葡萄球菌中，8株基因型為ermA，1株基因型為ermC，1株檢出同時帶有2種基因的菌株，1株未檢出任何基因型；10株cMLS耐藥的凝固酶陰性葡萄球菌菌株中，5株基因型為ermA，1株基因型為ermC，2株檢出同時帶有2種基因的菌株，2株未檢出任何基因型。由此可見，PC33復(fù)合板對克林霉素誘導(dǎo)型耐藥有較小的漏檢率。本研究中，cMLS耐藥菌株的主要耐藥基因為ermA，iMLS耐藥菌株的主要耐藥基因為ermC,這同喬昀等[14]的報道基本一致。

試驗中3株菌株(其中1株為金黃色葡萄球菌，2株為凝固酶陰性葡萄球菌)未發(fā)現(xiàn)以上2種基因的任何1種，其表型為紅霉素和克林霉素均耐藥，耐藥機制是否與攜帶其他基因如ermB、msrA(編碼大環(huán)內(nèi)酯類和鏈陽菌素共同耐藥基因)和msrB基因等有關(guān)，有待進一步研究。iMLS型耐藥在臨床上比較多見，主要耐藥基因為ermC，PCR可進行分子流行病學(xué)調(diào)查。目前臨床微生物實驗室使用PC33復(fù)合板進行克林霉素誘導(dǎo)耐藥的檢出率較高，能較好地指導(dǎo)臨床合理使用克林霉素治療。

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(本文編輯：姜敏)

張靜華，袁應(yīng)華，劉妍，成潔，孫奮勇

(同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院，上海 200072)

摘要：目的評價MicroScan革蘭陽性復(fù)合板(簡稱PC33復(fù)合板)和D試驗(紅霉素、克林霉素雙紙片法)檢測葡萄球菌誘導(dǎo)型克林霉素耐藥的性能及耐藥基因分析。方法檢測115株P(guān)C33復(fù)合板檢測結(jié)果為紅霉素耐藥而克林霉素敏感的葡萄球菌對紅霉素/克林霉素復(fù)合孔的耐藥性，同時用D試驗檢測紅霉素對克林霉素的誘導(dǎo)耐藥表型，用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測大環(huán)內(nèi)酯類-林可酰胺類-鏈陽霉素B類復(fù)合藥物(MLS)的耐藥基因。結(jié)果PC33復(fù)合板耐藥檢出率分別為金黃色葡萄球菌61.3%、凝固酶陰性葡萄球菌47.6%，D試驗?zāi)退帣z出率分別為金黃色葡萄球菌61.3%、凝固酶陰性葡萄球菌51.2%，2種方法的檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.5)。以D試驗為判斷標(biāo)準(zhǔn)計算PC33復(fù)合板檢測克林霉素誘導(dǎo)耐藥的敏感性為95.1%，特異性為100.0%；檢出erm基因常見的結(jié)構(gòu)型MLS(cMLS)耐藥基因ermA和誘導(dǎo)型MLS(iMLS)耐藥基因ermC。結(jié)論PC33復(fù)合板與D試驗檢測葡萄球菌誘導(dǎo)型克林霉素耐藥的結(jié)果有很好的一致性；PC33復(fù)合板有較好的臨床應(yīng)用價值。實驗室應(yīng)加強克林霉素誘導(dǎo)耐藥的檢測，以指導(dǎo)臨床合理選用抗菌藥物。

關(guān)鍵詞：誘導(dǎo)型克林霉素耐藥；葡萄球菌；MicroScan革蘭陽性復(fù)合板；D試驗；紅霉素；基因

Drug resistance evaluation and gene analysis on the detection of inducible clindamycin resistance inStaphylococcusby 2 phenotype testsZHANGJinghua，YUANYinghua，LIUYan，CHENGJie,SUNFenyong.(TheTenthPeople′sHospitalofTongjiUniversity，Shanghai200072，China)

Abstract:ObjectiveTo evaluate the drug resistance performance and drug resistance gene on the detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus by MicroScan Gram-positive composite plate(PC33 composite plate)and D test(erythromycin and clindamycin double-disk diffusion method). MethodsThe drug resistance of erythromycin/clindamycin composite well of the 115 isolates which were resistant to erythromycin and sensitive to clindamycin by MicroScan automatic identification was determined. Meanwhile， the inducible resistant phenotype of erythromycin to clindamycin was analyzed by D test， and the resistant gene to macrolide-lincosamide-streptogramin B (MLS) was detected by polymerase chain reaction(PCR). ResultsThe detection rates of PC33 composite plate were 61.3% for Staphylococcus aureus and 47.6% for coagulase-negative Staphylococcus. The detection rates of D test were 61.3% for Staphylococcus aureus and 51.2% for coagulase-negative Staphylococcus. The difference between the 2 methods had no statistical significance(P>0.5). Using D test as a standard to evaluate PC33 composite plate resistant to inducible clidamycin resistance， the sensitivity was 95.1%， and the specificity was 100.0%. The predominant gene for constitutive MLB(cMLS) resistance to clindamycin was ermA. The predominant gene for inducible MLS(iMLS)resistance to clindamycin was ermC. ConclusionsThe detection results of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus by MicroScan Gram-positive composite plate show a coincidence with D test. PC33 composite plate has good clinical significance. The detection of inducible clindamycin resistance should be paid attention in laboratories in order to guide physicians to select antimicrobial agents correctly.

Key words:Inducible clindamycin resistance；Staphylococcus；MicroScan Gram-positive composite plate；D test；Erythromycin；Gene

收稿日期：(2014-12-15)

通訊作者：孫奮勇，聯(lián)系電話：021-66306909。

作者簡介：張靜華，女，1984年生，學(xué)士，技師，主要從事臨床微生物檢驗工作。

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)12-1238-05R446.5

文獻標(biāo)志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.12.018