許曉峰，　江銘磊，　盧仁泉，　鄒淳緣，　龔志赟，　沈　利，　郭　林

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化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測抗TP抗體S/CO比值與確證試驗(yàn)陽性的相關(guān)性研究

許曉峰1，江銘磊2，盧仁泉2，鄒淳緣2，龔志赟2，沈利1，郭林2

梅毒是由梅毒螺旋體(treponema pallidum, TP)引起的一種慢性全身性性傳播疾病，臨床上診斷TP感染通常檢測抗TP特異性抗體，國內(nèi)常用的初篩試驗(yàn)包括TP顆粒凝集試驗(yàn)(treponema pallidum particle agglutination assay，TPPA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和化學(xué)發(fā)光免疫分析法(chemiluminescence immunoassay，CLIA)等，上述方法檢測抗TP抗體均存在一定的假陽性和假陰性[1]，但國內(nèi)不少實(shí)驗(yàn)室將初篩結(jié)果直接報(bào)告給臨床和患者，其中的假陽性結(jié)果會給受檢者帶來不必要的就醫(yī)和心理傷害。目前，已有更多的學(xué)者建議將免疫印跡法(western blotting，WB)作為梅毒血清學(xué)診斷的確證試驗(yàn)[2], 但考慮檢測成本和工作量，目前難以實(shí)行對每份篩查陽性的樣本均進(jìn)行確證試驗(yàn)。本研究探討2種CLIA系統(tǒng)測得的呈陽性反應(yīng)樣本的信號/臨界值(signal-to-cut off,S/CO)比值與WB結(jié)果的相關(guān)性，初步確定既能使篩查結(jié)果具有高陽性率，又減少需進(jìn)行確證試驗(yàn)樣本數(shù)的S/CO比值。

材料和方法

一、一般資料

208份經(jīng)Abbott i2000 CLIA系統(tǒng)(簡稱Abbott i2000)或科美東雅Chemclin 600 CLIA系統(tǒng)(簡稱Chemclin 600)檢測抗TP抗體 S/CO比值≥1.0的血清樣本采集于2012年6月至2014年7月間復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院普通住院患者，男106例，女102例，年齡31～82歲。上述樣本均在空腹條件下采集。靜脈血5 mL，3 000×g離心10 min，分離血清。-20 ℃條件下保存待測。

二、儀器和試劑

CLIA檢測抗TP抗體采用雅培公司Abbott i2000(美國)、北京科美東雅公司Chemclin 600及其配套試劑； WB試劑盒為德國歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑公司產(chǎn)品。

三、抗TP抗體初篩試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)的判斷限

Abbott i2000和Chemclin 600抗TP抗體初篩試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)的判斷限均為S/CO比值≥1.0。

四、WB確證試驗(yàn)

歐蒙TP-IgG-WB試劑膜條帶有6條，膜條上編號上部的黑色條帶為對照調(diào)整線，編號下部的黑色條帶為質(zhì)控條帶，中間有4條特異抗原條帶，分別為TpN47、TpN45、TpN17和TpN15，非特異的抗原條帶p22。結(jié)果判斷：陽性對照模板上的批號必須與膜條上的批號一致，質(zhì)控帶出現(xiàn)強(qiáng)的顏色反應(yīng)，結(jié)果有效。WB條帶陽性結(jié)果判讀：無特異抗原帶顯色為陰性,1條特異抗原帶顯色為可疑，2條及2條以上特異抗原帶顯色為陽性。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用抗TP抗體S/CO比值繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線，確定抗TP抗體篩查試驗(yàn)敏感性和特異性最佳時(shí)的S/CO比值。

結(jié)果

一、 CLIA系統(tǒng)抗TP抗體篩查結(jié)果比較

在208份樣本中，Abbott i2000抗TP抗體篩查呈陽性反應(yīng)(S/CO比值≥1.0)的血清樣本193份，Chemclin 600抗TP抗體篩查呈陽性反應(yīng)(S/CO比值≥1.0)的血清樣本196份，2個系統(tǒng)篩查結(jié)果符合率為87.02 %(181/208)。見表1。

表1　2個CLIA系統(tǒng)抗TP抗體篩查結(jié)果比較

二、Abbott i2000和Chemclin 600抗TP抗體篩查結(jié)果與WB確證試驗(yàn)結(jié)果的比較

1. CLIA系統(tǒng)篩查抗TP抗體與WB的符合率Abbott i2000檢測抗TP抗體S/CO比值≥1.0的血清樣本208份，呈陽性反應(yīng)的193份中去除WB不確定的42份，篩查陰性的15份中去除WB不確定的3份，Abbott i2000檢測抗TP抗體篩查結(jié)果與WB的符合率為82.2%[(125+9)/(125+26+9+3)] ；Chemclin 600檢測抗TP抗體S/CO比值≥1.0的血清樣本208份，呈陽性反應(yīng)的196份中去除WB不確定的42份，篩查陰性的12份中去除WB不確定的3份，Chemclin 600檢測抗TP抗體篩查結(jié)果與WB的符合率為82.8%[(127+8)/(127+27+1+8)]。見表2。

按ALTER等[3]在美國疾病預(yù)防控制中心擬定的“抗HCV的實(shí)驗(yàn)室檢測和結(jié)果報(bào)告指南”中對WB確證試驗(yàn)“不確定”結(jié)果的解釋，在排除檢測對象處于血清轉(zhuǎn)換過程的前提下，在低感染率人群中，WB“不確定”結(jié)果提示篩查試驗(yàn)的結(jié)果為假陽性，而本研究未能對WB“不確定”的樣本在1個月后重復(fù)取樣作WB或核酸檢測，因而不排除在WB結(jié)果“不確定”的樣本中，經(jīng)重復(fù)取樣檢測結(jié)果與篩查試驗(yàn)結(jié)果不一致所導(dǎo)致的符合率降低。

表2　CLIA系統(tǒng)抗TP抗體篩查結(jié)果與WB結(jié)果比較

2. WB確證試驗(yàn)結(jié)果的條帶特征 (1)WB陰性結(jié)果：35份WB陰性樣本中包括12份Chemclin 600陰性而Abbott i2000呈陽性反應(yīng)的樣本，15份Abbott i2000陰性而Chemclin 600呈陽性反應(yīng)的樣本。其他樣本Abbott i2000和Chemclin 600均為陰性。其中Abbott i2000的抗TP抗體最高S/CO比值為3.260，Chemclin 600的抗TP抗體最高S/CO比值為4.080。(2)WB陽性結(jié)果：WB陽性128份，WB陽性時(shí)4個抗原區(qū)分布情況見圖1。以TpN45、TpN17、TpN15最高，其中TpN45在128份樣本中全部呈陽性。(3)WB不確定結(jié)果：WB不確定45份，WB不確定樣本4個抗原區(qū)分布情況見圖2。陽性條帶主要在TpN15和TpN17，而TpN47則均為陰性。

二、以WB檢測結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)繪制CLIA系統(tǒng)ROC曲線

以WB檢測結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)(WB結(jié)果為“不確定”的樣本未列入)，用SPSS 19.0軟件對CLIA系統(tǒng)篩查抗TP抗體的S/CO比值繪制ROC曲線，見圖3。當(dāng)敏感性和特異性最佳時(shí)，確定Abbott i2000和Chemclin 600的S/CO比值分別為1.810和4.125。

三、 CLIA系統(tǒng)篩查抗TP抗體不同S/CO比值區(qū)間的陽性預(yù)測值

當(dāng)Abbott i2000和Chemclin 600篩查抗TP抗體的S/CO比值分別≥3.0和≥4.0時(shí)，篩查試驗(yàn)的陽性預(yù)測值≥95%。見表3。

圖1　128份WB陽性樣本4個抗原區(qū)分布情況

圖2　45份WB不確定樣本4個抗原區(qū)分布情況

圖3　Abbott i2000和Chemclin 600

抗TP抗體的S/CO比值Chemclin600WB-+不確定陽性預(yù)測值(%)Abbotti2000WB-+不確定陽性預(yù)測值(%)0~0.9981311.193325.01~1.991762626.12293129.02~2.9946760.0325789.33~3.99512070.6124296.04~4.99120495.20151100.05~5.990122100.00120100.06~9.99062100.00151100.010~19.99060100.0070100.020~29.990240100.00180100.030~39.990241100.0000-≥400110100.0000-

討論

免疫學(xué)檢驗(yàn)方法檢測病原體特異性抗體，由于方法學(xué)本身的問題和患者血清中的某些組分的干擾，都存在相當(dāng)比例的假陽性，且這一假陽性現(xiàn)象與試劑本身的性能質(zhì)量并無直接關(guān)聯(lián)。國內(nèi)外初篩實(shí)驗(yàn)室已規(guī)范執(zhí)行抗人類獲得性免疫缺陷病毒的結(jié)果報(bào)告程序；國外對ELISA或CLIA檢測抗丙型肝炎病毒抗體結(jié)果報(bào)告亦已形成一套規(guī)范化的程序；但國內(nèi)鮮有學(xué)者借鑒國外規(guī)范化的程序來制定抗TP抗體的初篩結(jié)果報(bào)告規(guī)范。本研究通過對208份用全自動CLIA系統(tǒng)(Abbott i2000及Chemclin 600)檢測的抗TP抗體篩選試驗(yàn)陽性樣本進(jìn)行WB確認(rèn)，來初步探討用這2個系統(tǒng)檢測抗TP抗體陽性預(yù)測值達(dá)95%時(shí)的臨界值，從而建立起適合本實(shí)驗(yàn)室的抗TP抗體初篩檢測及結(jié)果報(bào)告規(guī)則供臨床借鑒，也可藉此引起相關(guān)實(shí)驗(yàn)室工作人員和管理層的重視。

本研究結(jié)果顯示，Abbott i2000與WB的符合率為82.2%，Chemclin 600與WB的符合率為82.8%，與國內(nèi)學(xué)者報(bào)道結(jié)果相似[4-5]，符合率略低，這可能與樣本選取有關(guān)。樣本來源于復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院術(shù)前檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)的抗TP抗體S/CO比值≥1.0的血清樣本，后被收集入組，應(yīng)屬于TP感染的低危人群；其次腫瘤患者梅毒假陽性偏高。出現(xiàn)假陽性的原因可能與某些疾病對抗TP抗體產(chǎn)生干擾有關(guān)，如結(jié)腸癌、淋巴肉瘤、肝硬化、妊娠、自身免疫性疾病和其他基礎(chǔ)疾病等，這些疾病患者體內(nèi)可能含有抗類脂抗體或抗TP抗體的交叉抗原[6]。另外，年齡也是假陽性產(chǎn)生的一個重要因素，本研究CLIA檢測的假陽性樣本中部分患者年齡>50歲，這與老年人抗TP抗體測定的假陽性率偏高的報(bào)道相符[7-8]，可能是因?yàn)槔夏耆嗣庖吖δ芩ネ耍菀桩a(chǎn)生一些針對聯(lián)接用的白蛋白抗體或是一些異常蛋白質(zhì)干擾反應(yīng)[9]。

盡管WB檢測結(jié)果不受反復(fù)凍融、膽紅素、血紅蛋白等因素的影響，其特異性也較高，但本研究還是出現(xiàn)了一定例數(shù)的WB不確定結(jié)果，Abbott i2000和Chemclin 600檢測的208例樣本中各45例。WB結(jié)果不確定，即無法判斷抗TP抗體的結(jié)果，這種情況不排除低危人群中初篩檢測結(jié)果假陽性，同時(shí)還考慮與患者體內(nèi)抗體處在血清學(xué)轉(zhuǎn)換中或TP感染患者正在進(jìn)行治療有關(guān)。對于此類患者應(yīng)給予定期隨訪，即在3個月、半年、1年測其抗TP抗體，如S/CO比值保持在低值范圍，且無升高，則抗TP抗體假陽性可能性很大。此外，可以同時(shí)檢測TP DNA，以便得出確定的陽性和陰性結(jié)果，為臨床積累更多的經(jīng)驗(yàn)和提供確診TP感染的依據(jù)。本研究還對WB陽性條帶頻度分布作了統(tǒng)計(jì)， TpN45、TpN17、TpN15為最高，這與文獻(xiàn)[6，10]報(bào)道不盡一致。這可能與例數(shù)有限、樣本來源的局限、地域差異、TP基因型的不一致等有一定的關(guān)系。提示抗TP抗體篩查試劑抗原量應(yīng)注意各區(qū)的比例，比例不合適、過量均會造成假陽性。WB不確定的單一條帶陽性主要是在TpN15和TpN17區(qū)，TpN47甚至沒有，但是否減低篩查試劑中TpN47的量需進(jìn)一步探討。

CLIA檢測抗TP抗體以樣本的S/CO比值≥1.0作為陽性的依據(jù)，可檢測出血清抗體處于轉(zhuǎn)換中，抗TP抗體S/CO比值≥1.0處于低值的弱陽性樣本[11]，確保獻(xiàn)血員的血液安全以及一些創(chuàng)傷性檢測的安全。但在TP感染的低流行人群中，甚至99%的特異性也不能提供理想的陽性預(yù)測值。因此，不能單獨(dú)依靠初篩試驗(yàn)陽性結(jié)果來判斷一個人是否感染TP，需應(yīng)用具有更高特異性的補(bǔ)充確證試驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)分析。而ROC曲線是反映敏感性和特異性連續(xù)變量的綜合指標(biāo)[12]，本研究以WB檢測為金標(biāo)準(zhǔn)繪制Abbott i2000和Chemclin 600的ROC曲線，兼顧敏感性和特異性最佳時(shí)，Abbott i2000和Chemclin 600檢測抗TP抗體的S/CO比值分別為1.810和4.125。此外，從表3結(jié)果可見，當(dāng)Abbott i2000檢測抗TP抗體的S/CO比值≥3.0時(shí)，陽性預(yù)測值≥95.2%；Chemclin 600檢測抗TP抗體的S/CO比值≥4.0時(shí)，陽性預(yù)測值≥96.0%。基于以上數(shù)據(jù)，臨床上應(yīng)用初篩呈陽性反應(yīng)樣本的S/CO比值來確定是否需要進(jìn)行確證試驗(yàn)，可以減少需要進(jìn)行確證試驗(yàn)的工作量，同時(shí)也可提高報(bào)告檢測結(jié)果的可靠性，減少初篩檢測假陽性人群不必要的就醫(yī)和精神壓力[13]。

在本研究的基礎(chǔ)上，擬定一個CLIA檢測抗TP抗體結(jié)果報(bào)告的程序，供臨床借鑒：2個檢測系統(tǒng)檢測當(dāng)抗TP抗體結(jié)果S/CO比值<1.0時(shí)，直接報(bào)抗TP抗體陰性；當(dāng)Abbott i2000檢測抗TP抗體的S/CO比值≥3.0、Chemclin 600檢測抗TP抗體的S/CO比值≥4.0時(shí)，無須進(jìn)行WB確認(rèn)即可直接報(bào)告抗TP抗體陽性；當(dāng)Abbott i2000檢測抗TP抗體的S/CO比值在1.0～3.0、Chemclin 600檢測抗TP抗體的S/CO比值在1.0～4.0時(shí)，有條件的實(shí)驗(yàn)室建議進(jìn)行WB確認(rèn)或TP核酸檢測，以減少誤診率。建議每個用ELISA或CLIA檢測抗TP抗體的實(shí)驗(yàn)室在選用某一檢測試劑(或檢測系統(tǒng))前，都應(yīng)做與本研究類似的探討。

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(本文編輯：姜敏)

(1.同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，上海200092；

2.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032)

摘要：目的探討化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)檢測抗梅毒螺旋體(TP)抗體篩查試驗(yàn)信號/臨界值(S/CO)比值與確證試驗(yàn)陽性的相關(guān)性。方法經(jīng)Abbott i2000 CLIA系統(tǒng)(簡稱Abbott i2000)或科美東雅Chemclin 600 CLIA系統(tǒng)(簡稱Chemclin 600)檢測抗TP抗體S/CO比值≥1.0的血清樣本208份，用免疫印跡法(WB)對抗TP抗體篩查試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)評價(jià)。采用SPSS 19.0軟件繪制抗TP抗體S/CO比值受試者工作特性(ROC)曲線，得到敏感性和特異性最佳時(shí)的S/CO比值；計(jì)算各個S/CO比值區(qū)間的陽性預(yù)測值，得到陽性預(yù)測值≥95%的S/CO比值。結(jié)果Abbott i2000或Chemclin 600檢測抗TP抗體S/CO比值≥1.0的血清樣本208份，WB檢測陽性128份，陰性35份，不確定45份，2個CLIA系統(tǒng)與WB的符合率分別為82.2%和82.8%。當(dāng)Abbott i2000和Chemclin 600抗TP抗體篩查的S/CO比值分別為≥3.0和≥4.0時(shí)，陽性預(yù)測值≥95%。結(jié)論Abbott i2000和Chemclin 600檢測抗TP抗體的S/CO比值分別為1.0～3.0和1.0～4.0的樣本應(yīng)進(jìn)行WB確證試驗(yàn)，S/CO比值大于上述上限的樣本可直接報(bào)告抗TP抗體陽性，這樣既能減少確證試驗(yàn)的樣本數(shù)，又可提高檢測報(bào)告的可靠性。

關(guān)鍵詞：抗梅毒螺旋體抗體；化學(xué)發(fā)光免疫分析法；免疫印跡法

Study on the correlation between anti-TP antibody S/CO ratio by chemiluminescence immunoassay and positive results by confirmation assayXUXiaofeng1，JIANGMinglei2，LURenquan3，ZOUChunyuan2,GONGZhiyun2,SHENLi1,GUOLin2.(1.InstituteforInfectiousDiseasesandVaccineDevelopment,TongjiUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200092,China; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,ShanghaiCancerCenter,FudanUniversity/DepartmentofOncology,ShanghaiMedicalCollege,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the correlation between anti-treponema pallidum(TP)antibody signal-to-cut off(S/CO)ratio by chemiluminescence immunoassay (CLIA) and positive results by confirmation assay. MethodsA total of 208 anti-TP antibody positive samples (S/CO ratio≥1.0) were screened out by 2 CLIA systems, Abbott i2000 CLIA system (Abbott i2000)and Kemei Dongya Chemclin 600 CLIA system (Chemclin 600). The results were confirmed by western blotting (WB). Receiver operating characteristic(ROC)curve at optimal sensitivity and specificity was analyzed, and optimal S/CO threshold value was obtained by SPSS 19.0 software. The positive predictive value was calculated with every S/CO ratio interval， and the S/CO ratio of positive predictive value≥95%was obtained. ResultsBy Abbott i2000 or Chemclin 600, 208 samples′ S/CO ratio was determined.By WB, 35 cases of them were confirmed as negative, 128 cases were confirmed as positive, and 45 cases were indeterminate.The coincidence rates of WB compared with the 2 CLIA systems were 82.2% and 82.8%, respectively．When anti-TP antibody S/CO ratio of Abbott i2000 was ≥3.0, and anti-TP antibody S/CO ratio of Chemclin 600 was ≥4.0, the positive predictive value was ≥95%. ConclusionsIt is proposed that WB should be used if the S/CO ratio ranges are 1.0-3.0 determined by Abbott i2000 and 1.0-4.0 determined by Chemclin 600. If the S/CO ratio is above the upper limit, the samples can be reported as positive directly. It can not only reduce the confirmation assay sample number but also improve the reliability of determination report.

Key words:Anti-treponema pallidum antibody; Chemiluminescence immunoassay; Western blotting

收稿日期：(2015-02-17)

通訊作者：沈利，聯(lián)系電話：021-65985615。

作者簡介：許曉峰，男，1976年生，學(xué)士，主管技師，主要從事病原體免疫學(xué)研究。

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)12-1185-05R446.61

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.12.005