韓英，陳曉婷，王琨，張紅

(1.東北農業(yè)大學 動物科學技術學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.淡水魚類育種國家地方聯(lián)合工程實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；3.哈爾濱商業(yè)大學，黑龍江 哈爾濱 150028)

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興凱湖翹嘴鲌H-FABP基因的克隆及組織表達分析

韓英1、2，陳曉婷1、2，王琨3，張紅1、2

(1.東北農業(yè)大學 動物科學技術學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.淡水魚類育種國家地方聯(lián)合工程實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；3.哈爾濱商業(yè)大學，黑龍江 哈爾濱 150028)

摘要:為研究H-FABP基因在興凱湖野生和養(yǎng)殖翹嘴鲌Culter alburnus 各相同組織中表達的差異，根據(jù)GenBank中已知鯉科魚類的H-FABP基因序列進行引物設計，采用RT-PCR和RACE方法克隆出興凱湖翹嘴鲌心型脂肪酸結合蛋白(H-FABP)的全CDS區(qū)序列(402 bp)、3′UTR區(qū)序列(242 bp)和5′UTR區(qū)序列(134 bp)共778 bp的cDNA序列。將其提交到GenBank中，獲得基因登陸號為KJ629286,通過Blast比對發(fā)現(xiàn)，興凱湖翹嘴鲌H-FABP基因的CDS區(qū)與鯉Cyprinus carpio和齊口裂腹魚Schizothorax prenanti的同源性高達91%；氨基酸同源性比對顯示，興凱湖翹嘴鲌H-FABP氨基酸序列與虹鱒Oncorhynchus mykiss的同源性為76%，與斑馬魚Danio rerio的同源性為85%;分析野生翹嘴鲌7個組織(鰓、心臟、腸、肝胰臟、肌肉、腎臟、脾臟)以及養(yǎng)殖翹嘴鲌除心臟之外的6個相同組織H-FABP基因的表達情況，結果顯示,H-FABP基因在野生組和養(yǎng)殖組肝胰臟中表達量均為最高，與其他組織的表達量有顯著性差異(P<0.05)，H-FABP基因在野生組和養(yǎng)殖組各相同組織中的表達量無顯著性差異(P>0.05)。研究表明，興凱湖翹嘴鲌H-FABP基因序列高度保守，與鯉形目魚類的同源性更高。

關鍵詞:翹嘴鲌；興凱湖;心型脂肪酸結合蛋白；基因克隆；組織表達

肌內脂肪(IMF)含量是反映魚類肉質品質的重要指標，脂肪酸結合蛋白(fatty acid-binding protein，F(xiàn)ABP)基因作為影響肌內脂肪含量的候選基因之一，在脂肪酸轉運和脂類代謝中起著重要的作用，已引起學者的廣泛關注。目前，已從哺乳動物、禽類、魚類和昆蟲等生物細胞液中分離出多種類型的FABPs，如脂肪型脂肪酸結合蛋白(A-FABP)、腦型脂肪酸結合蛋白(B-FABP)、表皮型脂肪酸結合蛋白(E-FABP)、心型脂肪酸結合蛋白(H-FABP)、小腸型脂肪酸結合蛋白(I-FABP)、回腸型脂肪酸結合蛋白(IL-LBP)、肝胰臟型脂肪酸結合蛋白(L-FABP)、髓磷脂型脂肪酸結合蛋白(M-FABP)和睪丸型脂肪酸結合蛋白(T-FABP)[1]。其中,L-FABP能同時結合長鏈脂肪酸，而IL-LBP對脂肪酸沒有親和力，I-FABP在與配基發(fā)生結合的過程中其構象與其他類型的FABP構象不同。近年來，對B-FABP和E-FABP的研究較多，人類B-FABP氨基酸序列與其H-FABP氨基酸序列具有67%的同源性，而人類E-FABP氨基酸序列與其H-FABP氨基酸序列則有48%的同源性[2]。

在畜禽類FABPs基因家族中，對H-FABP的研究比較廣泛，多集中在多態(tài)性方面，而有關魚類H-FABP基因及其表達的研究報道尚少。Ando等[3]克隆了虹鱒OncorhynchusmykissH-FABP基因，與鼠心型脂肪酸結合蛋白的同源性為75%。Liu 等[4]描述了斑馬魚DaniorerioH-FABP基因結構，并將該基因定位在連鎖群上。Jordal等[5]測定了飼料脂肪酸對大西洋鮭SalmosalarH-FABP基因的影響，并分析了該基因在大西洋鮭不同生長階段的表達情況。林亞秋等[6]克隆了齊口裂腹魚Schizothoraxprenanti和鯉CyprinuscarpioH-FABP基因序列，并測定了該基因在各個組織中的表達量。覃川杰等[7]克隆了瓦氏黃顙魚PelteobagrusvachelliH-FABP基因cDNA序列，定量PCR反應分析表明，腹腔脂肪組織是心型脂肪酸結合蛋白表達的主要場所。俞菊華等[8]對建鯉H-FABP基因分離及其多態(tài)性與增重的相關性進行了分析，檢測了其中3個SNP位點的基因型，并篩選出與增重相關的分子標記。在GenBank中已經(jīng)收錄了鯉、斑馬魚、齊口裂腹魚、虹鱒、羅非魚Oreochromisniloticus、大西洋鮭、底鳉Fundulusheteroclitus、銀鱈魚Anoplopomafimbria等魚類的H-FABP基因cDNA序列。

興凱湖翹嘴鲌Culteralburnus體色銀白、肉質細嫩、味道鮮美，是中國重要的名貴經(jīng)濟魚類，也是古時歷代進京貢品和高級宴席佳肴，具有極高的經(jīng)濟價值，是中國四大名淡水魚之一。迄今為止，尚無其肉質性狀與基因調控的相關報道。本研究中，以野生和養(yǎng)殖興凱湖翹嘴鲌為試驗材料，利用PCR技術和RACE法克隆H-FABP基因，進行序列分析、比對，并應用RT-PCR技術分析該基因在不同組織中的表達規(guī)律，探索興凱湖翹嘴鲌肌內脂肪含量的調控機制，為進一步研究魚類的肉質奠定基礎，同時為其分子遺傳育種提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

試驗用野生翹嘴鲌采自黑龍江省興凱湖，養(yǎng)殖翹嘴鲌采自黑龍江農墾振達興凱湖大白魚研究所養(yǎng)殖基地，體質量為(142.1±6.3)g，野生組和養(yǎng)殖組翹嘴鲌樣本均為5尾，每組設3個重復。

感受態(tài)細胞、DNATaq酶、dNTP、Buffer、DNA Marker等試劑，均購自北京全式金生物技術有限公司。RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒，均購自?；锟萍加邢薰尽?′-Full RACE Core Set 2.0試劑盒、5′-Full RACE試劑盒、PMD18-T Vector試劑盒和熒光定量試劑盒，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2方法

1.2.1樣品的制備使用無RNA酶處理的手術刀和剪刀進行解剖，采集鮮活魚體的肝胰臟、心臟、脾臟、腸、肌肉、腎臟和腮，迅速置于液氮中，于超低溫冰箱(-80 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2H-FABP基因cDNA的克隆提取翹嘴鲌心臟組織RNA，使用紫外分光光度計以及瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA。OD260 nm/OD280 nm值在1.8~2.0之間，而且凝膠成像顯示分別在28 S、18 S、5 S三處有條帶。用3 μg總RNA進行反轉錄，反應程序：30 ℃下反應5 min，42 ℃下反應30 min，95 ℃下反應5 min，共循環(huán)30次，4 ℃下保存。

參考已發(fā)表的鯉H-FABP基因序列(登錄號：JQ342672.1)，使用Primer 5.0軟件設計上下游引物H1；采用興凱湖翹嘴鲌心臟組織的總RNA為模板并擴增出部分cDNA序列，根據(jù)其H-FABP基因部分CDS區(qū)序列設計RACE法擴增3′端和5′端所需的2對引物H3′和H5′(表1)，從而擴增出興凱湖翹嘴鲌的H-FABP基因全cDNA序列。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，回收目的條帶。將回收產物與PMD-18T載體連接，轉化后篩選出陽性克隆，在NCBI上比對測序后的序列同源性。

表1　克隆H-FABP基因的引物

1.2.3H-FABP基因表達量的檢測從心臟、肝胰臟、脾臟、腎臟、腸、鰓、肌肉各組織中提取總RNA，進行反轉錄。使用Primer 5.0軟件設計FQ-PCR引物(表2)，采用FQ-PCR法檢測H-FABP基因在各組織中的相對表達量。PCR反應程序:95 ℃下預變性15 s；95 ℃下變性5 s，60 ℃下退火34 s，共進行40個循環(huán)；60 ℃下延伸1 min。

表2　FQ-PCR引物

1.3數(shù)據(jù)處理

應用NCBI上的Blast程序，比對克隆出的序列與其他物種的同源性。使用DNAMAN軟件拼接克隆出的cDNA序列。使用Mega 4.0軟件進行堿基組成和變異分析并采用Neighbor-joining(NJ)法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對表達量進行顯著性檢驗。

2結果與分析

2.1翹嘴鲌H-FABP基因cDNA克隆及序列分析

注：起始密碼子和終止密碼子用方框標出Note：Initiation codon and termination codon are marked in a box圖1　興凱湖翹嘴鲌H-FABP基因全cDNA序列Fig.1　Complete sequence of cDNA of H-FABP gene in culter Culter alburnus in Xingkai Lake

采用RT-PCR和RACE法克隆并測序得到了翹嘴鲌H-FABP基因共778 bp的cDNA序列(圖1)。該基因5′端非翻譯區(qū)長134 bp，3′非翻譯區(qū)長242 bp，起始密碼子為 ATG，終止密碼子為 TAA，PolyA加尾信號為 AATAAA。完整的開放閱讀框由402 bp組成，編碼133個氨基酸。將其提交到GenBank，獲得基因登陸號為KJ629286。將所得氨基酸序列提交至NCBI，通過Blast比對氨基酸同源性，結果表明,興凱湖翹嘴鲌H-FABP氨基酸序列與齊口裂腹魚、鯉同源性均為91%,與斑馬魚同源性為85%,與長鰭真鮰Ictalurusfunctatus同源性為83%,與大西洋鮭、虹鱒、銀鱈魚、底鳉等魚類同源性為75%,與人Homosapiens、豬Susscrofa、牛Bostaurus、雞Gallusgallus、大鼠Rattusnorvegicus、小鼠Musmusculus等哺乳動物和禽類的同源性為75%左右。興凱湖翹嘴鲌H-FABP氨基酸數(shù)目與鯉、斑馬魚、長鰭真鮰、大西洋鮭、虹鱒相同，均編碼133個氨基酸,但比底鳉(編碼132個氨基酸)多1個氨基酸，比銀鱈魚(編碼134個氨基酸)少1個氨基酸。使用ClustalW在線比對，結果顯示：僅在FABP胞質脂肪酸結合蛋白信號區(qū)其與齊口裂腹魚和鯉有一個絲氨酸(S)突變成蘇氨酸(T)的差異；與長鰭真鮰有一個從天冬氨酸(D)突變?yōu)楣劝彼?E)的差異；與斑馬魚有2個氨基酸突變的差異，分別為丙氨酸(A)到甘氨酸(G)的突變和天冬氨酸(D)到谷氨酸(E)的突變。

2.2翹嘴鲌H-FABP氨基酸序列的系統(tǒng)進化分析

將興凱湖翹嘴鲌H-FABP氨基酸序列與鯉、齊口裂腹魚、斑馬魚、虹鱒、長鰭真鮰、銀鱈魚、大西洋鮭、底鳉、人、牛、豬、雞、大鼠、小鼠的H-FABP氨基酸序列使用ClustalX 1.83軟件進行多重比較分析，使用Mega 4.0程序中的Maxinum Parsimony和Neighbor-joining算法，設Bootstrap為1000，構建遺傳進化樹，結果如圖2所示。從圖2可見，興凱湖翹嘴鲌首先與斑馬魚、齊口裂腹魚和鯉聚在一起，然后與長鰭真鮰聚在一起，再與虹鱒和大西洋鮭聚在一起，最后與底鳉和銀鱈魚聚在一起，與其他魚類、鳥類和哺乳類差異較大，分布在兩個分支上。

圖2　翹嘴鲌H-FABP氨基酸序列的遺傳進化樹Fig.2　Phylogenetic tree of amino acid sequences in H-FABP in culter Culter alburnus

2.3H-FABP基因的組織表達

從圖3可見：H-FABP基因在翹嘴鲌野生組和養(yǎng)殖組肝胰臟中表達量均為最高，與其他組織的表達量有顯著性差異(P<0.05)；但野生組和養(yǎng)殖組各相同組織中的表達量均無顯著性差異(P>0.05)。

注：標有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)Note:The means with different letters are significant differences at the 0.05 probability level, and the means with the same letters are not significant differences圖3　翹嘴鲌H-FABP基因在各組織中的相對表達量Fig.3　Relative expression of H-FABP gene in tissues of culter Culter alburnus

3討論

克隆新基因時，常選擇親緣關系相近物種的氨基酸序列保守區(qū)設計引物。經(jīng)克隆、測序與比對分析，興凱湖翹嘴鲌H-FABP基因全CDS區(qū)序列共402 bp，編碼一個終止密碼子和133個氨基酸。本試驗中，將克隆得到的H-FABP氨基酸序列與其他物種H-FABP的同源性進行比較，結果顯示，興凱湖翹嘴鲌H-FABP氨基酸序列與同屬鯉形目的鯉和齊口裂腹魚同源性高達91%，與非同目的斑馬魚同源性亦高達91%，與長鰭真鮰同源性達83%，與大西洋鮭、虹鱒、銀鱈魚、底鳉等魚類同源性均在75%左右，與人、牛、小鼠、大鼠、豬、雞等哺乳動物和禽類的同源性均為75%左右，由此可驗證所得序列即為興凱湖翹嘴鲌的H-FABP序列。興凱湖翹嘴鲌H-FABP氨基酸數(shù)目與鯉、斑馬魚、長鰭真鮰、大西洋鮭、虹鱒相同，均編碼133個氨基酸；但比銀鱈魚(編碼134個氨基酸)少1個氨基酸，比底鳉(編碼132個氨基酸)多1個氨基酸。該序列具有高度保守性，這對于保持H-FABP的基本功能具有重要意義。

趙旭庭等[9]研究表明，H-FABP基因在鴨的腦和腎中有微量表達，在小腸、脂肪、腺胃、肌胃、骨骼肌和肺組織中均有中度表達，在心臟組織中表達量最高，在卵巢、脾和肝中不表達。在對魚類H-FABP基因的研究中， Liu等[4]研究表明，H-FABP基因在斑馬魚卵巢和肝中表達最豐富，在心、腦、精巢、皮膚、肌肉、腸中均有不同程度的表達；林亞秋等[6]研究發(fā)現(xiàn)，H-FABP基因在齊口裂腹魚和鯉肝胰臟中表達量最高，且表達量顯著高于其他組織，在鯉各組織中表達量由高到低依次為心臟、脾、腎、腦、鰓、脂肪、肌肉，在齊口裂腹魚各組織中表達量由高到低依次為心臟、腦、鰓、腎、肌肉、脂肪、脾。本研究中，對興凱湖翹嘴鲌各組織的H-FABP基因mRNA相對表達量進行比較后發(fā)現(xiàn)，該基因在肝胰臟中的表達量顯著高于其他組織，在肌肉、心臟、脾和腸中均有中度表達，在鰓和腎中僅有微量表達。動物的肝臟、脂肪組織和小腸是合成脂肪的主要場所，以肝臟的合成能力最強。已有研究表明，興凱湖翹嘴鲌、鯉和齊口裂腹魚H-FABP基因在肝胰臟組織中表達量均高于其他組織，說明其表達具有肝胰臟特異性。

H-FABP具有促進細胞內脂肪酸轉運的功能，與長鏈脂肪酸的親和力很強，其具有轉運長鏈脂肪酸以及調節(jié)脂肪酸代謝平衡之功能[4，10]，可將脂肪酸運送到胞內脂肪及磷脂合成部位。研究表明，H-FABP基因與新疆細毛羊的IMF含量無相關性，與20～90日齡哈薩克羊的IMF含量呈顯著正相關[11]；李文娟等[12]研究發(fā)現(xiàn)，H-FABP基因與矮腳雞的IMF含量無相關性，與北京油雞和白萊航雞的IMF含量呈顯著負相關；林亞秋等[6]測定了3種規(guī)格鯉和齊口裂腹魚在不同飼養(yǎng)條件下相同繁殖周期內的IMF含量，并對H-FABP基因的表達量進行相關分析后發(fā)現(xiàn)，齊口裂腹魚H-FABP基因表達量與IMF含量呈顯著正相關，而鯉該基因表達量與IMF含量呈顯著負相關，造成這種差異的原因，可能是由于兩種魚的脂肪轉運與貯存分子調控機制以及生長環(huán)境不同。筆者在前期的研究中，對3齡、4齡、5齡興凱湖野生和養(yǎng)殖翹嘴鲌的IMF和脂肪酸含量進行了分析，結果表明，在野生組中檢測到18種脂肪酸，其中肌肉飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸、二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸的總量顯著高于養(yǎng)殖組(P<0.05)，隨著年齡的增長，野生組肌肉脂肪含量顯著低于養(yǎng)殖組[13-14]。本研究結果顯示，H-FABP基因在野生組和養(yǎng)殖組各相同組織中的表達量無顯著性差異。因此，H-FABP基因表達量與IMF的相關性具有物種差異性。魚類脂肪代謝由多種基因共同協(xié)調作用，H-FABP作為肉質脂肪性狀的候選基因之一，其對IMF含量的影響仍有待于進一步研究。

H-FABP作為影響肉質嫩度的主效基因，其多態(tài)性及分子標記尚需進一步研究。這對于了解魚類肉質形成的分子機制，實現(xiàn)優(yōu)質性狀的早期選擇，加快良種尤其是優(yōu)良肉質魚類的選擇育種，具有重要的意義。

參考文獻：

[1]陳志輝，徐良梅，單安山.脂肪酸結合蛋白及其基因[J].東北農業(yè)大學學報，2006，37(5):689-692.

[2]Haunerland N H,Spener F.Fatty acid-binding proteins insights from genetic manipulations[J].Prog Lipid Research，2004，43(4):328-349.

[3]Ando S,Xue X H,Tibbits G F,et al.Cloning and sequencing of complementary DNA for fatty acid binding protein from rainbow trout heart[J].Comparative Biochemistry and Physiology. Part B:Biochemistry and Molecular Biology,1998,119(1):213-217.

[4]Liu R Z，Denovan-Wright E M,Wright J M.Structure，linkage mapping and expression of the heart-type fatty acid-binding protein gene (fabp3) from zebrafish (Daniorerio)[J].European Journal of Biochemistry,2003,270(15):3223-3234.

[5]Jordal A E,Hordvik I,Pelsers M,et al.FABP3 and FABP10 in Atlantic salmon (SalmosalarL.) general effects of dietary fatty acid composition and life cycle variations[J].Comparative Biochemistry and Physiology.Part B:Biochemistry and Molecular Biology,2006,145(2):147-158.

[6]林亞秋，李瑞文，鄭玉才，等.齊口裂腹魚和鯉魚 H-FABP 基因的克隆及其表達譜[J].中國生物化學與分子生物學報，2011，27(6):554-560.

[7]覃川杰，陳立僑，李二超，等.瓦氏黃顙魚脂肪酸結合蛋白基因cDNA片段的克隆及分析[J].福建農林大學學報:自然科學版，2012，41(3):259-265.

[8]俞菊華，李紅霞，李建林，等.建鯉FABP3基因分離及其多態(tài)性與增重的相關分析[J].水產學報,2012，36(12):1809-1818.

[9]趙旭庭，董飚，張紅，等.鴨H-FABP基因的克隆及其組織表達[J].江蘇農業(yè)學報，2009，25(5):1082-1085.

[10]Storch J,Thumser A E.The fatty acid transport function of fatty acid-binding proteins[J].Biochimica Biophysica Acta-Molecular and Cell Biology of Lipids,2000,1486(1):28-44.

[11]Huang Z G,Xiong L,Liu Z S,et al.The development changes and effect on IMF content of H-FABP and PPAR mRNA expression in sheep muscle[J].Yichuan Xuebao,2006,33(6):507-514.

[12]李文娟，李宏賓，文杰，等.雞H-FABP和A-FABP基因表達與肌內脂肪含量相關研究[J].畜牧獸醫(yī)學報，2006，37(5):417-423.

[13]韓英，王琨，程寶晶，等.不同年齡野生和養(yǎng)殖興凱湖翹嘴鲌肌肉營養(yǎng)成分分析[J].中國水產科學,2012，19(5):906-912.

[14]王琨，韓英，董建國，等.興凱湖翹嘴鲌野生和養(yǎng)殖組脂肪酸及相關血液指標的比較[J].淡水漁業(yè)，2012，42(3):14-18.

Cloning and expression ofH-FABPgene in tissues of

culterCulteralburnusin Xingkai Lake

HAN Ying1,2, CHEN Xiao-ting1,2, WANG Kun3, ZHANG Hong1,2

(1.Animal Science and Technology College, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China;2. Country Location United Engineering Laboratory of Freshwater Fish Breeding, Harbin 150030, China;3. Harbin University of Commerce, Harbin 150028, China)

Abstract：The 778 bp cDNA sequence including whole CDS sequence (402 bp), whole 3′UTR sequence (242 bp) and partial 5′UTR sequence (134 bp) of heart type fatty acid binding protein (H-FABP) in culter Culter alburnus was cloned by RT-PCR and RACE technology to evaluate difference between the amount of expression of H-FABP gene in wild and farmed culter in Xingkai Lake, according to the H-FABP gene sequences of members in Cyprinidae known in Genbank with accession number of KC782835. The Blast showed that there was 91% homology in H-FABP gene CDS area between culter and common carp Cyprinus carpio and prenant’s schizothoracin Schizothorax prenanti. The comparison of amino acid homology revealed that the H-FABP gene of the culter showed 76% homology with rainbow trout Oncorhynchus mykiss and 85% homology with zebrafish Danio rerio.The expression of H-FABP gene in 7 tissues (gill, heart, intestine, hepatopancreas, muscle, kidney, spleen) of wild Culter alburnus and in 6 tissues except heart of cultured culter indicated that the maximal mRNA expression of H-FABP gene was observed in hepatopancreas of wild and cultured culter, with significantly different from other tissues (P<0.05). In the same tissue, however, there was no significant difference in mRNA expression level of H-FABP gene in wild and cultured culter (P>0.05). It is concluded that the conservative H-FABP gene in culter had high homology with that in members in Cyprinidae.

Key words：Culter alburnus; Xingkai Lake; heart type fatty acid binding protein (H-FABP); gene cloning; tissues expression

作者簡介：韓英(1963—)，女，教授，博士生導師。E-mail：hanying606@163.com

基金項目：黑龍江省博士后啟動基金資助項目(LRB10-633(SN))；黑龍江省自然科學基金資助項目(C200934)

收稿日期：2014-06-20

中圖分類號：Q78

文獻標志碼：A

文章編號：2095-1388(2015)02-0120-05

DOI：10.3969/J.ISSN.2095-1388.2015.02.002