劉永新，劉奕，周勤，張紅濤

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京 100141；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 珠江水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510380；3.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 北戴河中心實(shí)驗(yàn)站，河北 秦皇島 066100)

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利用微衛(wèi)星標(biāo)記指導(dǎo)紅鰭東方鲀親本選配

劉永新1，劉奕2，周勤3，張紅濤3

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京 100141；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 珠江水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510380；3.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 北戴河中心實(shí)驗(yàn)站，河北 秦皇島 066100)

摘要:為制定紅鰭東方鲀家系配組方案提供可行性指導(dǎo)，利用微衛(wèi)星標(biāo)記輔助紅鰭東方鲀Takifugu rubripes家系的建立,選擇34個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)紅鰭東方鲀兩個(gè)群體進(jìn)行遺傳評(píng)估。結(jié)果表明：A群體的平均等位基因數(shù)(Na)和Nei基因多樣性指數(shù)(He)分別為6.647 0和0.711 5，B群體的相應(yīng)值分別為4.647 1和0.646 1，且兩個(gè)群體之間的遺傳差異達(dá)到顯著性水平(P<0.05)；群體間的遺傳分化系數(shù)(GST)為0.050 7，基因流(Nm)為4.679 6, 表明紅鰭東方鲀?nèi)后w間存在低程度的遺傳分化和一定程度的基因交流；分子方差分析(AMOVA)表明，遺傳變異主要存在于群體內(nèi)，所占比例為78.49%，而群體之間僅占21.51%；根據(jù)群體間Nei氏遺傳距離構(gòu)建UPGMA系統(tǒng)樹，群體內(nèi)個(gè)體之間的遺傳距離為0.11~0.82，依據(jù)遺傳距離的遠(yuǎn)近將全部個(gè)體分成多個(gè)分支，不同分支內(nèi)含有數(shù)個(gè)個(gè)體；各項(xiàng)遺傳參數(shù)表明，試驗(yàn)群體具備一定程度的遺傳變異，不同個(gè)體之間擁有相對(duì)較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，可以根據(jù)個(gè)體之間遺傳距離制定育種計(jì)劃，建立家系進(jìn)行選育研究。研究表明，利用微衛(wèi)星標(biāo)記信息構(gòu)建紅鰭東方鲀家系的方法是切實(shí)可行的。

關(guān)鍵詞:紅鰭東方鲀；群體；微衛(wèi)星；遺傳距離

紅鰭東方鲀Takifugurubripes隸屬于硬骨魚綱Osteichthyes、鲀形目Tetraodontiformes、鲀亞目Tetraodontoidei、鲀總科Tetraodntoidea、鲀科Tetraodontidae、東方鲀屬Takifugu，俗稱河豚，主要分布于中國(guó)的渤海、黃海和東海，以及日本沿海和朝鮮半島[1]。紅鰭東方鲀?nèi)赓|(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、高蛋白、低脂肪并含有豐富的維生素和微量元素，素有“魚中之王”的美譽(yù)[2-5]。紅鰭東方鲀的養(yǎng)殖始于20世紀(jì)80年代日本，其養(yǎng)殖方式以陸上水池人工養(yǎng)殖為主，但養(yǎng)殖產(chǎn)量無(wú)法滿足日本民眾的需求，因此，每年還需從中國(guó)進(jìn)口大量的商品魚。中國(guó)的紅鰭東方鲀?nèi)斯ゐB(yǎng)殖始于1991年， 但由于中國(guó)自然資源量明顯小于日本，而且紅鰭東方鲀和假睛東方鲀Takifugupseudommus兩個(gè)物種具有相近的繁殖季節(jié)和棲息海區(qū)，非常容易發(fā)生混交，從而為中國(guó)的紅鰭東方鲀養(yǎng)殖生產(chǎn)和市場(chǎng)穩(wěn)定帶來(lái)了不利影響[6]。國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖的品種價(jià)格不高、種質(zhì)不純，出口受限制是養(yǎng)殖戶面臨的實(shí)際問(wèn)題。中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所在1996年首次引進(jìn)日本紅鰭東方鲀種群，在國(guó)內(nèi)確立了純種引進(jìn)技術(shù)，同時(shí)形成了全人工純種育苗的大規(guī)模生產(chǎn)。迄今為止，國(guó)內(nèi)有很多養(yǎng)殖公司仍然采用從日本引種的方式進(jìn)行生產(chǎn)，在繁育了1~2代后養(yǎng)殖苗種明顯出現(xiàn)生長(zhǎng)速度緩慢、抗逆性降低的現(xiàn)象，為了解決這些問(wèn)題只能再次從國(guó)外引種，因此，紅鰭東方鲀養(yǎng)殖業(yè)受國(guó)外種質(zhì)資源控制的影響非常嚴(yán)重。如何利用引進(jìn)群體和國(guó)內(nèi)本土資源開展良種選育研究，盡快培育出滿足市場(chǎng)需求的優(yōu)良品種并提供長(zhǎng)期穩(wěn)定的供應(yīng)，是當(dāng)前育種工作者亟待解決的根本問(wèn)題。

國(guó)內(nèi)對(duì)紅鰭東方鲀遺傳的研究雖有所開展，但多以形態(tài)性狀[7-9]、群體結(jié)構(gòu)和生化遺傳變異[10-11]、分子標(biāo)記開發(fā)[12-14]和種內(nèi)雜交[15-16]等研究為主，未見有系統(tǒng)性的優(yōu)良品種選育進(jìn)程報(bào)道。到目前為止，沒(méi)有紅鰭東方鲀品種通過(guò)國(guó)家原良種審定委員會(huì)審定并予以推廣養(yǎng)殖。選擇育種技術(shù)是水產(chǎn)動(dòng)物品種遺傳改良過(guò)程中應(yīng)用最為廣泛的方法，雜交育種和分子標(biāo)記育種等育種技術(shù)都要以選擇育種為基礎(chǔ)來(lái)開展。即使是現(xiàn)在，部分水產(chǎn)動(dòng)物品種都已完成了基因組測(cè)序，隨之而產(chǎn)生的全基因組育種技術(shù)也同樣離不開選擇育種。從已有研究基礎(chǔ)來(lái)看，紅鰭東方鲀主要經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳改良采用常規(guī)的選擇育種技術(shù)更為適合。開展選擇育種首先需要構(gòu)建具有豐富遺傳變異的基礎(chǔ)群體；其次，要借助分子標(biāo)記技術(shù)分析群體的遺傳結(jié)構(gòu)，判斷遺傳變異度和群體內(nèi)個(gè)體之間的遺傳距離，制定相應(yīng)的親本配組方案，建立選育家系[17]。多種分子標(biāo)記都能夠進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，隨機(jī)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性DNA、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性和微衛(wèi)星DNA技術(shù)先后在不同歷史時(shí)期應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物遺傳研究中。現(xiàn)階段，微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記是進(jìn)行群體分析的首選標(biāo)記，眾多水產(chǎn)動(dòng)物品種如牙鲆Paralichthysolivaceus[18]、大菱鲆Scophthalmusmaximus[19]、黃顙魚Pseudobagrusfulvidraco[20]、大黃魚Pseudosciaenacrocea[21]、吉富羅非魚Oreochromisniloticus[22]、赤點(diǎn)石斑魚Epinephelusakaara[23]等都利用這種標(biāo)記分析了目標(biāo)群體的遺傳基礎(chǔ)。本研究中，以從日本進(jìn)口的紅鰭東方鲀受精卵發(fā)育至性成熟的親本組成育種群體，利用34個(gè)微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記分析該群體的遺傳結(jié)構(gòu)，了解其遺傳變異水平并進(jìn)行UPGMA系統(tǒng)聚類，確定個(gè)體之間的遺傳距離，旨在為大規(guī)模建立選育家系和開展分子標(biāo)記輔助育種研究工作提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)用紅鰭東方鲀親魚共計(jì)225尾，其中199尾來(lái)自河北省唐山市天河水產(chǎn)養(yǎng)殖公司(記為A群體)，26尾來(lái)自河北省昌黎縣河鲀魚良種場(chǎng)(記為B群體)。天河養(yǎng)殖有限公司從1995—1999年，每年由日本直接引進(jìn)受精卵進(jìn)行苗種孵化，并從事養(yǎng)殖，2000年時(shí)上述引進(jìn)的苗種達(dá)到性成熟，將這些成熟的河鲀作為親魚；之后為防止近交衰退，每?jī)傻饺暧扇毡疽M(jìn)一次受精卵更新種魚，試驗(yàn)所采集的A群體為該公司養(yǎng)殖至今保有的親魚群體。河北省昌黎縣河鲀魚良種場(chǎng)親魚B群體也是由日本進(jìn)口的受精卵經(jīng)孵化、培育至性成熟的個(gè)體產(chǎn)生的后代，但其引種時(shí)間不同于天河養(yǎng)殖有限公司，為2005—2007年。所有親魚年齡為4～6齡，體質(zhì)量為0.8～3.5 kg。采集親魚尾部鰭條用于提取基因組DNA。

1.2方法

1.2.1微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選與PCR擴(kuò)增選擇由日本學(xué)者[24]和中國(guó)學(xué)者[10-12]開發(fā)的34個(gè)高多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行試驗(yàn)分析。標(biāo)記名稱、引物序列和退火溫度列于表1。由上海生工生物工程服務(wù)有限公司負(fù)責(zé)引物合成。利用TIANGEN海洋動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA的提取。提取完成后，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA樣品的質(zhì)量，用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè) DNA 濃度(A260/280值在1.8～2.0 之間較好)；之后，稀釋 DNA 至 50 ng/μL，于冰箱(-20 ℃)中保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)體系(共25 μL)：10×Buffer 2.5 μL,Mg2+(25 mmol/L)1 μL,dNTPs(各2 mmol/L)1 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,模板DNA (50 ng/μL)1 μL,TaqDNA聚合酶1 U，用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃下預(yù)變性3 min；94 ℃下變性30 s，退火30 s，72 ℃下延伸30 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下延伸10 min。在AB9700型PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.2PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，上樣緩沖液由0.25%的溴酚藍(lán)和40%的蔗糖水溶液組成。電泳后用1%硝酸銀染色10 min，顯色液顯色10 min。凝膠在HP scanjet G4010掃描儀上成像，用Gel-Pro Analyzer 4.5凝膠分析軟件對(duì)電泳譜帶進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。

1.3數(shù)據(jù)處理

每對(duì)微衛(wèi)星引物檢測(cè)一個(gè)位點(diǎn)，每條多態(tài)性帶為一個(gè)等位基因。利用Popgene 3.2軟件[25]統(tǒng)計(jì)每個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因數(shù)(Number of alleles，Na)、Nei基因多樣性指數(shù)(Nei’s gene diversity index，He)和Nei遺傳距離(Genetic Distance，GD)[26]。采用Wilcoxon 配對(duì)檢驗(yàn)法進(jìn)行A群體和B群體等位基因數(shù)和Nei 基因多樣性指數(shù)的顯著性檢驗(yàn)。根據(jù)Nei遺傳距離進(jìn)行非加權(quán)類平均法(UPGMA)系統(tǒng)聚類。基于每一個(gè)位點(diǎn)的等位基因差異，采用Arlequin 3.0軟件[27]中的分子方差分析程序(AMOVA)計(jì)算F統(tǒng)計(jì)量(F-statistics，F(xiàn)st)，分析紅鰭東方鲀?nèi)后w的遺傳分化，采用Excoffier 等[28]的非參數(shù)置換方法(3000次)進(jìn)行Fst的顯著性檢驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1紅鰭東方鲀?nèi)后w的遺傳參數(shù)

利用34個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行紅鰭東方鲀?nèi)后w的遺傳分析，統(tǒng)計(jì)每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)和Nei基因

表1　34個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的名稱、引物序列和退火溫度

多樣性指數(shù)。從表2可見，不同的微衛(wèi)星位點(diǎn)具有較大的差異性。A群體的等位基因數(shù)為3~13，B群體的為0~12；A群體的Nei基因多樣性指數(shù)為0.456 6~0.875 0，B群體的為0~0.840 2。從表3 可知，兩個(gè)群體的等位基因數(shù)和Nei 基因多樣性指數(shù)的平均值均較高, 表明這兩個(gè)群體資源均具有較豐富的多樣性。Wilcoxon 配對(duì)測(cè)驗(yàn)表明，A群體平均等位基因數(shù)(6.647 0)和Nei基因多樣性指數(shù)(0.711 5)均高于B群體(4.647 1和0.646 1)，且具有顯著性差異(P<0.05)。由此表明，A群體具有更加豐富的遺傳多樣性。

2.2紅鰭東方鲀?nèi)后w的遺傳分化

根據(jù) Nei基因多樣性指數(shù)計(jì)算兩個(gè)群體總的遺傳分化系數(shù)(GST)為0.050 7，由GST計(jì)算種群間的基因流值(Nm)為4.679 6，說(shuō)明這兩個(gè)紅鰭東方鲀?nèi)后w之間存在著一定程度的基因交流。分子方差分析(AMOVA)結(jié)果表明，遺傳變異主要存在于群體內(nèi)部，所占比例為78.49%，而群體之間的遺傳變異僅占21.51%(表4)。

表2　紅鰭東方鲀兩個(gè)群體在34個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)和Nei基因多樣性指數(shù)

表3紅鰭東方鲀兩個(gè)群體在34個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的平均等位基因數(shù)和Nei基因多樣性指數(shù)

Tab.3Mean number of alleles and average Nei’s gene diversity index at 34 microsatellite loci in two populations of redfin puffer

群體group樣本數(shù)numberofsample等位基因數(shù)Na平均值±標(biāo)準(zhǔn)差mean±S.D.P值PvalueNei基因多樣性指數(shù)He平均值±標(biāo)準(zhǔn)差mean±S.D.P值PvalueAB199266.6470±2.6501a4.6471±1.9677b0.00050.7115±0.0914a0.6461±0.1445b0.0240

注：同列中標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)

Note:The means with different letters within the same column are significant differences at the 0.05 probability level

2.3聚類分析

表4　紅鰭東方鲀?nèi)后w的分子方差分析

兩個(gè)群體共計(jì)225個(gè)個(gè)體的Nei遺傳距離為0.11~0.82，表明這些個(gè)體之間既有遺傳差異較大的個(gè)體，也存在遺傳差異較小的個(gè)體?；贜ei遺傳距離進(jìn)行UPGMA系統(tǒng)聚類(圖1)，在Nei遺傳距離為0.82處可以明顯地劃分為兩類：A分支和B分支，A分支包含221個(gè)個(gè)體，而B分支僅包含來(lái)自B群體的4個(gè)個(gè)體(B23~B26)。在遺傳距離為0.66處同樣明顯地分成兩類，較大的分支為C分支，包括192個(gè)個(gè)體，較小的分支為D分支，包括29個(gè)個(gè)體。C分支在遺傳距離為0.65處分為E、F兩個(gè)分支，分別包含95和97個(gè)個(gè)體，其中E分支在遺傳距離為0.59處又分為I和J兩個(gè)分支。而F分支在遺傳距離為0.61處分為G和H兩個(gè)分支，其中G分支在遺傳距離為0.57處分為K和L兩個(gè)分支，而H分支在遺傳距離為0.59處分為M和N兩個(gè)分支。C分支在遺傳距離小于0.60處細(xì)化成的6個(gè)分支I、J、K、L、M和N所包含的個(gè)體數(shù)依次為48、47、26、21、48和2個(gè)，其中I、J和K分支基本全部由來(lái)自A群體的個(gè)體組成，而大多數(shù)來(lái)自B群體的個(gè)體集合在M分支內(nèi)。在遺傳距離為0.11～0.60時(shí)，I、J、K、L、M和N分支內(nèi)的個(gè)體按照遺傳距離的遠(yuǎn)近程度聚集在不同的小分支內(nèi)。

圖1　親魚群體的親緣關(guān)系聚類圖Fig.1　Cluster dengrodogram of parental population

3討論

3.1群體遺傳學(xué)參數(shù)

傳統(tǒng)的水產(chǎn)動(dòng)物選擇育種在進(jìn)行家系構(gòu)建時(shí)往往僅根據(jù)個(gè)體表型性狀是否優(yōu)良確定其是否作為繁殖用親本。伴隨著分子生物學(xué)技術(shù)日新月異的發(fā)展，不同種類的分子標(biāo)記已經(jīng)引入到家系選育過(guò)程中，通過(guò)判斷基礎(chǔ)群體的遺傳變異和群體內(nèi)個(gè)體之間的遺傳距離，可為親本個(gè)體的選擇和配組方案的制定提供參考依據(jù)。利用這種方法組建家系的魚類品種有建鯉Cyprinuscarpio[29]、團(tuán)頭魴Megalobramaamblycephala[30]、虹鱒Oncorhynchusmykiss[31]等。遺傳多樣性是種群進(jìn)化和遺傳改良的前提和基礎(chǔ)[32]，物種的遺傳多樣性越高，其獲得的遺傳進(jìn)展就越大。本研究中，所選群體的平均等位基因數(shù)和Nei基因多樣性指數(shù)分別為4.647 1和0.646 1以上，與已有報(bào)道的紅鰭東方鲀?nèi)毡救后w和秦皇島群體的參數(shù)基本相同[10]，而顯著高于公司養(yǎng)殖群體和實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖群體[11]。需要指出的是，雖然本試驗(yàn)中選擇了幾百個(gè)個(gè)體進(jìn)行分析，但這些個(gè)體全部來(lái)自引進(jìn)的受精卵，不敢確定一定存在遺傳漂變，同時(shí)也無(wú)法確認(rèn)是否能夠代表日本原來(lái)的自然群體。為此，本研究中還選擇了萬(wàn)玉美等[10]進(jìn)行紅鰭東方鲀兩個(gè)自然群體遺傳學(xué)研究時(shí)所用的微衛(wèi)星標(biāo)記，因?yàn)樗麄冞x擇和評(píng)估這些標(biāo)記，依據(jù)的是一個(gè)能代表自然群體的理想群體。除了上述兩個(gè)遺傳指標(biāo)外，筆者也計(jì)算了Hardy-Weinberg遺傳偏離指數(shù)，發(fā)現(xiàn)在當(dāng)前群體中存在平衡偏離問(wèn)題，而依據(jù)標(biāo)記計(jì)算遺傳多樣性，描述群體結(jié)構(gòu)的意義并不大，因?yàn)槿绻艢w這些個(gè)體，這一結(jié)構(gòu)馬上會(huì)解體而不存在。對(duì)指導(dǎo)配組工作而言，試驗(yàn)的主要目的不是描述多樣性和群體結(jié)構(gòu)，而是獲取個(gè)體之間遺傳差異的信息，為實(shí)際育種服務(wù)。以本研究中所選的遺傳參數(shù)指標(biāo)等位基因數(shù)為例，每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)都不相同，這其中就存在一個(gè)取樣飽和度的問(wèn)題。一個(gè)位點(diǎn)有十幾個(gè)等位基因，盡管有幾百個(gè)個(gè)體，仍會(huì)有很多等位基因只有一個(gè)，頻率極低，這時(shí)群體內(nèi)個(gè)體數(shù)量就不是30個(gè)，而需要300個(gè)甚至更多，因此，不是等位基因數(shù)愈多越好，只是在尋找個(gè)體差異的時(shí)候，等位基因數(shù)是越多越好。這里所強(qiáng)調(diào)的不是等位基因數(shù)量對(duì)群體研究的要求，而是等位基因數(shù)量對(duì)尋找個(gè)體差異的重要意義。

3.2群體內(nèi)個(gè)體選配

分子方差分析表明，目標(biāo)群體的大部分遺傳變異存在于群體內(nèi)部，少量的遺傳差異存在于群體之間。由于AMOVA分析不必作Hardy-Weinberg假設(shè)，避免了數(shù)學(xué)假設(shè)帶來(lái)的系統(tǒng)誤差，其結(jié)合UPGMA系統(tǒng)聚類結(jié)果，可以更好地輔助微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行個(gè)體遺傳差異評(píng)估，作為建立家系的依據(jù)。魚類的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近程度常用遺傳距離來(lái)衡量，根據(jù)遺傳距離對(duì)親魚進(jìn)行聚類分析，能夠?yàn)橛H本配組和雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)提供參考依據(jù)[32]。本研究中的UPGMA系統(tǒng)聚類結(jié)果中，A分支和B分支在遺傳距離為0.82處分開，這表明兩個(gè)分支內(nèi)的個(gè)體具有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，原則上可以作為配組對(duì)象。但是，B分支內(nèi)個(gè)體數(shù)量過(guò)少，僅包括4個(gè)個(gè)體。這在實(shí)際育種工作中就會(huì)面臨兩個(gè)問(wèn)題，其一，在繁殖季節(jié)親魚一般都需要進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化，從而保證其能夠孕育健康、優(yōu)質(zhì)的精子和卵子。親魚強(qiáng)化過(guò)程需要較為精湛的培育技術(shù)，在這一過(guò)程中雄性親魚容易產(chǎn)生活力不錯(cuò)的精子，但對(duì)雌性親魚往往不能保證全部待產(chǎn)個(gè)體都能夠產(chǎn)生好的卵子，卵子質(zhì)量較差或者生殖腺膨大卻不能產(chǎn)出卵子的情況時(shí)有發(fā)生，從而導(dǎo)致預(yù)先設(shè)計(jì)的交配方案不能實(shí)施。因此，對(duì)于僅包含幾個(gè)個(gè)體的B分支，一旦個(gè)體性腺發(fā)育不理想則無(wú)法進(jìn)行配組。其二，即使B分支內(nèi)個(gè)體性腺正常發(fā)育，但其數(shù)量過(guò)少，很容易成為一個(gè)單性別小群體，在配組時(shí)，只能做正交或反交的單向設(shè)計(jì)，且組合數(shù)也較少，產(chǎn)生性狀優(yōu)良組合的幾率也將降低。此外，AMOVA分析結(jié)果表明，主要的遺傳變異來(lái)自于群體內(nèi)部而非群體之間，因此，應(yīng)盡量考慮設(shè)計(jì)A群體或B群體內(nèi)的個(gè)體配組。鑒于上述幾點(diǎn)考慮，分支D、I、J、K、L、M和N之間的遺傳距離(0.57～0.65)相對(duì)較遠(yuǎn)，這些分支內(nèi)的個(gè)體可設(shè)計(jì)交配方案。這7個(gè)分支內(nèi)還存在細(xì)化的小分支，這些小分支的遺傳距離范圍為0.11～0.57。有文獻(xiàn)報(bào)道，家系生長(zhǎng)在一定范圍內(nèi)隨著親本遺傳距離的增大而逐漸增加，但是隨著遺傳距離的進(jìn)一步增大，生長(zhǎng)有下降的趨勢(shì)。這表明配組親本的遺傳距離與生長(zhǎng)之間存在一個(gè)閾值點(diǎn)，一旦超過(guò)這個(gè)閾值點(diǎn)，即使遺傳距離再增加其生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)反而會(huì)降低，這一論斷在鯉中已經(jīng)取得試驗(yàn)驗(yàn)證[33]，除水產(chǎn)物種外，對(duì)部分作物的研究也得出了相似的結(jié)論[34-37]。參考這些研究結(jié)果，在本試驗(yàn)群體中對(duì)親本遺傳距離為0.11～0.60范圍內(nèi)的分支也可設(shè)計(jì)交配，一方面可以獲得更多的組合，有助于在大規(guī)模組合中優(yōu)中選優(yōu)，另一方面可以驗(yàn)證紅鰭東方鲀這一物種是否也存在類似的“閾值”理論。一旦發(fā)現(xiàn)閾值點(diǎn)，在今后的育種工作中便可集中于這一區(qū)域進(jìn)行配組設(shè)計(jì)，從而加速優(yōu)良組合的產(chǎn)生，用于新品種或新品系的篩選。本試驗(yàn)中對(duì)紅鰭東方鲀?nèi)后w遺傳的分析結(jié)果，可以直接用于指導(dǎo)親魚配組實(shí)踐，開展大規(guī)模家系選育，進(jìn)行生長(zhǎng)、抗病、品質(zhì)、性別等多元化性狀的遺傳改良研究。育種材料是進(jìn)行選育的根本所在，本研究中僅收集了日本群體的后代，如果想要獲得持續(xù)、穩(wěn)步的遺傳進(jìn)展還應(yīng)收集中國(guó)不同海域的自然資源或繼續(xù)引進(jìn)韓國(guó)、朝鮮等外來(lái)資源，不斷增加基礎(chǔ)群體的遺傳變異，才能為盡快培育出滿足養(yǎng)殖需求的新品種奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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Application of microsatellite markers in parental apolegamy

of redfin pufferTakifugurubripes

LIU Yong-xin1, LIU Yi2, ZHOU Qin3, ZHANG Hong-tao3

(1.Chinese Academy of Fishery Sciences, Beijing 100141, China; 2.Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510380, China; 3.Beidaihe Central Experiment Station, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qinhuangdao 066100, China)

Abstract：A family mating plan of redfin puffer Takifugu rubripes was established by parental apolegamy assisted by microsatellite markers and by analysis of genetic variations and distances of parental populations, and genetic evaluation was carried out in two populations of the redfin puffer by a set of 34 microsatellite markers. The results showed that there were significantly higher allele number (6.647 0) and Nei’s gene diversity index (0.711 5) in population A than those (allele number 4.647 1 and Nei’s gene diversity index 0.646 1) in population B, significant genetic differences between the two populations (P<0.05). The genetic differentiation coefficient GSTof 0.050 7 and Nmof 4.679 6 indicated that there were inferior differentiation and some degree of gene exchange among the redfin puffer populations. AMOVA revealed that there was 78.49% variation within the population while there was 21.51% variation between the two populations. The UPGMA tree established by genetic distance indicated that the genetic distance (GD) among individuals within the population was varied from 0.11 to 0.82. All individuals were divided into different branches on basis of genetic distance magnitude. Each genetic parameter demonstrated that there were genetic variations to some extent in experimental population and distant relatives among individuals. The breeding schedule can be made according to the genetic distances among individuals, and then families can be produced for selective breeding. The findings indicate that the method is feasible for establishment of families in redfin puffer with microsatellite marker information.

Key words：Takifugu rubripes; population; microsatellite; genetic distance

通信作者：周勤(1963—)，高級(jí)工程師。E-mail:laozhou529@hotmail.com

作者簡(jiǎn)介：劉永新(1979—)，博士，副研究員。E-mail:liuyx@cafs.ac.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD26B01)；中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(2013A0505)

收稿日期：2014-06-27

中圖分類號(hào)：S917

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：2095-1388(2015)02-0113-07

DOI：10.3969/J.ISSN.2095-1388.2015.02.001