劉青，崔延超，李雙宇，付泉潔，揣潔

(大連海洋大學(xué) 遼寧省水生生物學(xué)重點實驗室，遼寧 大連 116023)

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聚維酮碘對褶皺臂尾輪蟲的毒性效應(yīng)

劉青，崔延超，李雙宇，付泉潔，揣潔

(大連海洋大學(xué) 遼寧省水生生物學(xué)重點實驗室，遼寧 大連 116023)

摘要:通過聚維酮碘對褶皺臂尾輪蟲Brachionus plicatilis幼體的急性、慢性毒性試驗，研究了聚維酮碘對輪蟲存活、生長和繁殖的影響。結(jié)果表明：聚維酮碘對褶皺臂尾輪蟲幼體的24 h LC50為2.25 mg/L，48 h LC50為1.99 mg/L，應(yīng)用Turubell公式得出其安全濃度為0.47 mg/L；褶皺臂尾輪蟲的平均存活時間、總生殖量、平均生殖次數(shù)和每次生殖個數(shù)均隨聚維酮碘濃度的升高而減少，產(chǎn)前發(fā)育期則隨濃度的升高而延長，其中0.5 mg/L高濃度組的這些種群增長參數(shù)與對照組及其他各濃度組間均有顯著性差異(P<0.05)；內(nèi)稟增長率(rm)、凈增值率(R0)和周限增長率(λ)隨濃度的升高而降低，世代周期(T)則隨濃度的升高而升高，其中0.5 mg/L高濃度組的rm、λ、T與對照組及其他各濃度組間有顯著性差異(P<0.05)。研究表明，0.1 mg/L低濃度聚維酮碘對褶皺臂尾輪蟲的存活、產(chǎn)前發(fā)育時間影響不大，即與對照組無顯著性差異(P>0.05)， 但對其種群增長、繁殖有顯著影響(P<0.05)。

關(guān)鍵詞:褶皺臂尾輪蟲；聚維酮碘；毒性試驗；安全濃度

聚維酮碘(povidone-iodine)為碘伏類殺菌劑，它是由分子碘與聚乙烯吡咯烷酮(PVP)結(jié)合而成的高分子化合物(PVP-I)[1]。其殺菌機理主要是遇組織中的還原物時，緩慢釋放出游離碘而氧化細(xì)菌、病毒等原漿蛋白的活性基團, 并與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合而使其變性，從而殺滅細(xì)菌、真菌、病毒等病原體。聚維酮碘因其性能穩(wěn)定，并具有高效、低毒、無殘留、毒副作用小的特點, 是目前國內(nèi)首選的皮膚黏膜和外科消毒劑，并已擴大應(yīng)用到口腔、婦科等其他醫(yī)療領(lǐng)域[2]。

聚維酮碘還具有受水體pH、鹽度、溫度影響較小的特點，在水產(chǎn)養(yǎng)殖魚、蝦、蟹、貝、藻的殺菌消毒上已被廣泛使用，在水產(chǎn)經(jīng)濟動物類的疾病防治中起到重要作用[3-4]。目前，有關(guān)聚維酮碘對水生生物的毒性效應(yīng)已有較多報道[5-16]，但研究內(nèi)容主要是急性毒性試驗方面，而對水域環(huán)境中生物的存活、種群增長與繁殖的進一步研究報道較少，因此，對于其使用后是否會對水體生態(tài)環(huán)境中其他生物的存活、種群繁殖造成影響，值得深入研究。

輪蟲是水域環(huán)境中常見的一種浮游動物，對環(huán)境變化較為敏感，本試驗中以褶皺臂尾輪蟲Brachionusplicatilis為受試生物，研究了不同濃度的聚維酮碘對其生存、生長和繁殖的影響，以期為聚維酮碘在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的安全使用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

褶皺臂尾輪蟲由大連海洋大學(xué)水生生物學(xué)重點實驗室提供，以小球藻Chlorellasp.為餌料擴大培養(yǎng)，試驗所用輪蟲均選用新生的同步輪蟲幼體。輪蟲培養(yǎng)液是用過濾煮沸海水和曝氣自來水配制而成，鹽度為15(鹽度計VR-211)。

聚維酮碘購自東莞市中加消毒科技有限公司，用硫代硫酸鈉滴定后，測得有效碘濃度為2740 mg/L。本研究中提到的聚維酮碘濃度，均指有效碘濃度。為保證聚維酮碘的有效濃度，聚維酮碘試液均為每次使用前配制。

1.2方法

1.2.1聚維酮碘對褶皺臂尾輪蟲的急性毒性試驗首先進行聚維酮碘對褶皺臂尾輪蟲的毒性預(yù)試驗，根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，急性毒性試驗按等對數(shù)間距設(shè)置1.35、1.80、2.40、3.20、4.20、5.60、7.50 7個濃度組，另設(shè)1個空白對照組。試驗用12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入5 mL試液和5只新生輪蟲幼體，每組設(shè)3個平行(即3個12孔細(xì)胞培養(yǎng)板)。試驗在GXZ-380B型恒溫光照培養(yǎng)箱中進行，溫度為(25±1)℃，光照強度為1500 lx，光周期為12∶12(L∶D)，急性毒性試驗不喂食。觀察記錄1、2、4、6、12、24、48 h輪蟲個體的死亡情況。

1.2.2聚維酮碘對褶皺臂尾輪蟲的慢性毒性試驗依據(jù)急性試驗結(jié)果求得聚維酮碘的安全濃度，根據(jù)安全濃度值，慢性試驗設(shè)置0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L 5個濃度組，另設(shè)1個空白對照組。試驗用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔中加入3 mL試液和1只新生同步輪蟲幼體，每組設(shè)3個平行(即3個24孔細(xì)胞培養(yǎng)板)。每24 h更換一次培養(yǎng)液，以小球藻為餌料，各試驗組保持餌料藻密度為1.28 ×106ind./mL。每天觀察記錄輪蟲的生長、生殖情況，同時挑出新生輪蟲個體，試驗至輪蟲全部死亡結(jié)束。其他試驗條件同“1.2.1”節(jié)。

1.2.3半致死濃度的計算采用概率單位法[17]計算半致死濃度。即通過各組試驗24 h和48 h的死亡率，計算平均死亡率，轉(zhuǎn)換成概率單位；再將各組試驗聚維酮碘濃度轉(zhuǎn)換成濃度對數(shù)，以濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，概率單位為縱坐標(biāo)作圖，擬合概率單位-濃度對數(shù)回歸方程，從而計算24 h半致死濃度(24 h LC50)和48 h半致死濃度(48 h LC50)。

1.2.4安全濃度的計算安全濃度(SC，mg/L)通過Turubell公式[18]計算：

SC=0.3×48 h LC50/(24 h LC50/48 h LC50)2。

1.2.5生命表參數(shù)的計算根據(jù)試驗結(jié)果數(shù)據(jù)，計算內(nèi)稟增長率(rm)、凈生殖率(R0)、世代周期(T)和周限增長率(λ)并編制生命表，內(nèi)稟增長率通過Lotka提出經(jīng)Birch和林昌善簡化的公式[19]計算得出。

T=lnR0/rm，

λ=erm。

其中：x為日齡(d)；lx為x日齡時的存活率；mx為x日齡時的出生率。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，并用Duncan法進行多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2結(jié)果與分析

2.1聚維酮碘對褶皺臂尾輪蟲的急性毒性試驗

不同聚維酮碘濃度組褶皺臂尾輪蟲的存活率如表1所示。從表1可見：在試驗開始的1 h內(nèi)，各濃度組均無死亡個體；2 h 后隨著聚維酮碘濃度的增加，褶皺臂尾輪蟲的存活率呈下降趨勢；6 h后5.60 mg/L和7.50 mg/L兩個高濃度組的輪蟲個體幾乎無存活個體；至24 h時，2.40、3.20、4.20 mg/L 3個中濃度組的輪蟲存活率也不及50%；但1.35 mg/L和1.80 mg/L兩個低濃度組的存活率都保持較高值，48 h的存活率也達到近60%； 而對照組存活率始終穩(wěn)定在100%。

表1　不同聚維酮碘濃度下褶皺臂尾輪蟲的存活率

通過概率單位法求得24 h濃度對數(shù)與概率單位的直線回歸方程為

y=3.9125x+3.6187，R2=0.9811,

計算得到24 h LC50為(2.250±0.093)mg/L。同樣求得48 h濃度對數(shù)與概率單位的直線回歸方程為

y=3.6773x+3.9018，R2=0.9809，

計算得到48 h LC50為(1.990±0.102)mg/L。再根據(jù)安全濃度計算公式，求得SC為0.47 mg/L。

圖1　24 h和48 h條件下概率單位與聚維酮碘濃度對數(shù)的線性關(guān)系Fig.1　Liner relationship of probit and logarithm of povidone-iodine concentrations in 24 h and 48 h

2.2聚維酮碘對褶皺臂尾輪蟲生長和繁殖的影響

各濃度組聚維酮碘對褶皺臂尾輪蟲生長和繁殖影響結(jié)果如表2所示。從表2可以看出，輪蟲的平均存活時間、總生殖量、一生平均生殖次數(shù)、每次生殖個數(shù)均隨聚維酮碘濃度的升高而呈降低趨勢，產(chǎn)前發(fā)育期則隨濃度的升高而呈延長趨勢。

方差分析和Duncan多重比較結(jié)果表明：平均存活時間以對照組最長，為(11.875±0.355)d，除0.1 mg/L濃度組外，其他濃度組與對照組均存在顯著性差異(P<0.05)；總生殖量亦是對照組最高，為(31.833±2.499)ind./只，各濃度組與對照組均存在顯著性差異(P<0.05)；一生平均生殖次數(shù)和每次生殖個數(shù)亦是對照組最高，除0.1 mg/L濃度組的平均生殖次數(shù)外，其他濃度組與對照組均存在顯著性差異(P<0.05)；產(chǎn)前發(fā)育期亦是對照組最短，為(2.18±0.02)d，除0.1 mg/L濃度組外，其他濃度組與對照組均存在顯著性差異(P<0.05)。

表2　不同聚維酮碘濃度下褶皺臂尾輪蟲的生長、繁殖狀況

注：同列中標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同

Note:The means with different letters within the same column are significant differences at the 0.05 probability level,and the means with the same letters within the same column are not significant differences,et sequentia

2.3聚維酮碘對褶皺臂尾輪蟲種群增長參數(shù)的影響

根據(jù)試驗結(jié)果編制如表3所示的生命表。由表3可以看出，各組均在第2日開始有新個體出生，且第2日對照組出生率顯著高于試驗組(P<0.05)，0.1 mg/L濃度組與其他各試驗組均存在顯著差異(P<0.05)，至14日，0.1 mg/L濃度組出生率高于對照組。0.5 mg/L高濃度組在第7日開始出現(xiàn)死亡個體,而0.1 mg/L和0.2 mg/L低濃度組則在第10日時才出現(xiàn)死亡個體。

不同聚維酮碘濃度組中褶皺臂尾輪蟲種群增長參數(shù)如表4所示。從表4可見：rm、R0和λ均隨濃度的升高而降低，T隨濃度的升高而延長；對照組rm最高，約為0.59/(ind.-1·d-1)，各濃度組與對照組間均存在顯著性差異(P<0.05)；對照組R0也最高，約為29.82，0.1~0.3 mg/L低濃度組與對照組無顯著性差異(P>0.05)；對照組λ也最高，約為1.81/(ind.-1·d-1)，各濃度組與對照組均存在顯著性差異(P<0.05)；0.5 mg/L高濃度組T最長，約為6.20 d，各濃度組與對照組均存在顯著性差異(P<0.05)。

表3　不同聚維酮碘濃度下褶皺臂尾輪蟲的生命表

注：同行中標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)

Note:The means with different letters within the same line are significant differences at the 0.05 probability level,and the means with the same letters within the same line are not significant differences

表4　不同聚維酮碘濃度下褶皺臂尾輪蟲的種群增長參數(shù)

3討論

3.1聚維酮碘對水生生物的急性毒性效應(yīng)

作為殺菌劑，聚維酮碘已經(jīng)在水產(chǎn)養(yǎng)殖魚、蝦、蟹的殺菌消毒方面得到廣泛應(yīng)用[3]。已有研究表明，各類水生生物對聚維酮碘的敏感性依種類不同而有很大差異。由表5可以看出，泥鰍Misgurnusanguillicaudatus、沙蠶Perinereisaibuhitensis等底棲生活種類對聚維酮碘最不敏感，扁吻魚Aspiorhynchuslaticeps幼魚、點籃子魚Siganusguttatus幼魚等次之。受試生物對毒物的敏感性，不僅各生物類群之間存在著很大差異，即使是同一類生物，不同種之間也存在明顯的差異。同是甲殼動物的蝦類，聚維酮碘對青蝦Macrobrachiummipponensis幼蝦和斑節(jié)對蝦Penaeusmonodon仔蝦的安全濃度相差20倍以上。

從本研究的急性試驗結(jié)果得出，聚維酮碘對褶皺臂尾輪蟲的24 h LC50值為2.25 mg/L，48 h LC50值為1.99 mg/L，LC50值均低于個體較大的水產(chǎn)經(jīng)濟動物，褶皺臂尾輪蟲的安全濃度為0.47 mg/L，也大多低于表5中所列的水產(chǎn)經(jīng)濟動物。

表5不同水生動物對聚維酮碘的半致死濃度和安全濃度

Tab.5Median lethal concentration and safety concentration of povidone iodine in different aquatic organisms

mg/L

3.2聚維酮碘對褶皺臂尾輪蟲種群增長的影響

輪蟲是水域環(huán)境中常見的一種浮游動物，其個體小、繁殖力強、營養(yǎng)豐富，為水域環(huán)境中魚類及其他水生動物的天然餌料。輪蟲主要攝食水體中的浮游植物、細(xì)菌、有機碎屑等，其數(shù)量種群變動影響著水域環(huán)境的物質(zhì)循環(huán)和能量流動。因其生殖量大、周期短，以輪蟲作為受試生物的毒性研究多有報道。金解敏[20]研究表明，褶皺臂尾輪蟲對Cu2+和 Zn2+的敏感性存在差異。謝欽銘等[21]研究表明，孔雀石綠、高錳酸鉀和甲醛對褶皺臂尾輪蟲的24 h LC50分別為0.613、0.873、11.277 mg/L；謝志浩等[22]研究表明，百草枯對褶皺臂尾輪蟲的24 h LC50為 9.17 mg/L；加上本試驗的研究結(jié)果，綜合得到褶皺臂尾輪蟲對5種消毒藥物的敏感性依次為孔雀石綠>高錳酸鉀>聚維酮碘>百草枯>甲醛，這說明褶皺臂尾輪蟲對各類藥物的耐受性也有較大差異。根據(jù)國家環(huán)境保護局1989年頒布的《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則》[23]，參考溞類毒性標(biāo)準(zhǔn)，1.0 mg/L<48 h EC50≤10 mg/L為中毒性，推斷聚維酮碘對褶皺臂尾輪蟲為中毒性藥物。

急性毒性試驗是評價毒物最直接的方法，當(dāng)深入評價某一毒物的毒性強度時，急性毒性試驗已不能滿足需求，需要做低濃度下的慢性毒性試驗，以觀察毒物對受試生物的壽命、繁殖和種群增長及其他生理指標(biāo)等的影響。目前，還缺乏聚維酮碘對受試生物的慢性毒性試驗研究。本試驗結(jié)果表明，濃度為0.2 mg/L以上的聚維酮碘對褶皺臂尾輪蟲的壽命、繁殖和種群增長有顯著影響，而與對照組相比，0.1 mg/L的聚維酮碘雖然對褶皺臂尾輪蟲的存活、產(chǎn)前發(fā)育時間影響不大(P>0.05)，但總生殖量、每次生殖個數(shù)、內(nèi)稟增長率、世代周期和周限增長率均與對照組有顯著性差異(P<0.05)，因此，濃度為0.1 mg/L的聚維酮碘對輪蟲種群增長和繁殖也有顯著影響。

聚維酮碘為環(huán)境外源性藥物，在魚、蝦、蟹、貝病害防治時作為消毒劑，有時會在養(yǎng)殖池塘中全池潑灑，使用劑量常為0.2～0.5 mg/L[3]，該劑量通常在經(jīng)濟水產(chǎn)動物的安全濃度范圍內(nèi)。在日常使用中，若只考慮到經(jīng)濟水產(chǎn)動物的安全性，而忽略了對輪蟲等小型浮游動物的影響，長此以往，將會對養(yǎng)殖水環(huán)境中其他微小生物造成危害，進而影響水域生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。因此，生產(chǎn)中要根據(jù)實際情況酌情使用聚維酮碘。

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Toxicity of povidone-iodine to rotiferBrachionusplicatilis

LIU Qing, CUI Yan-chao, LI Shuang-yu, FU Quan-jie, CHUAI Jie

(Key Laboratory of Hydrobiology in Liaoning Province, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China)

Abstract：The acute and chronic toxicity of povidone-iodine to rotifer Brachionus plicatilis was studied to evaluate influence of povidone-iodine on survival, growth and reproduction of the rotifer. The result showed that the LC50of this chemical was 2.25 mg/L in 24 h, and 1.99 mg/L in 48 h, with safe concentration of 0.47 mg/L by Turubell formula. The life-span, life-time fecundity, number of broods per female and number of young per brood of the rotifer were found to be decrease with the increase in povidone-iodine concentration, and the development of pre-reproduction was extended with the increase in povidone-iodine concentration, with significant difference between the high concentration group(0.5 mg/L) and the control group and between the other groups (P<0.05). The intrinsic rate of increase(rm)，net productive rate(R0) and finite rate of increase(λ) were shown to be decrease with the increase in povidone-iodine concentration, and the mean generation time(T) was increased with the increase in concentration. There were significant difference in rm,λ, and T between high povidone-iodine concentration group (0.5 mg/L) and the control group and between the other groups (P<0.05). The findings indicated that the low concentration of povidone-iodine (0.1 mg/L) showed no significant effect on survival and development of pre-reproduction of the rotifer (P>0.05), but had significant impact on growth and reproduction of the rotifer(P<0.05).

Key words：Brachionus plicatilis; povidone-iodine; toxicity test; safe concentration

作者簡介：劉青(1965—), 女, 副教授。E-mail:liuqing@dlou.edu.cnmg/L

基金項目：國家海洋公益項目(201305005)；國家海洋局近岸海域生態(tài)環(huán)境重點實驗室資助項目(201310)

收稿日期：2015-01-05

中圖分類號：Q179.2

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：2095-1388(2015)02-0149-06

DOI：10.3969/J.ISSN.2095-1388.2015.02.007