韓殿冰　曾本華　葛成果

1)河南汝州市人民醫(yī)院肝膽外科　汝州　467500； 2)第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物研究所　重慶　400000；

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內(nèi)毒素在小鼠肝癌發(fā)生過程中的作用

韓殿冰1)曾本華2)葛成果3)

1)河南汝州市人民醫(yī)院肝膽外科汝州467500； 2)第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物研究所重慶400000；

資料表明，微生物在癌癥的發(fā)生中起著重要作用，例如幽門螺桿菌是引起胃癌發(fā)生的重要因素[1]，人類乳頭狀瘤病毒是引起宮頸癌的重要因素[2]，特異性的細菌感染是引起結(jié)直腸癌的重要因素[3]。但細菌是否也是引起肝癌的重要因素及細菌的代謝產(chǎn)物內(nèi)毒在肝癌的發(fā)生中起到何種作用，均為今后臨床需關(guān)注的問題。

1材料與方法

1.1主要試劑二乙基亞硝銨(N-Nitrosodiethylamine,DEN)、脂多糖和抗內(nèi)毒素IgY(Immunoglobulin yolk，IgY；北京百靈威科技有限公司)。內(nèi)毒素(LPS E.Coli0111:B4；美國Sigma公司)。內(nèi)毒素測定所用試劑盒(上海伊華臨床醫(yī)學(xué)科技公司)。

1.2動物分組和模型建立6周齡BaLB/C無菌雄性小鼠20只，購于第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物所，普通6周齡BaLB/C雄性小鼠20只，購于鄭州大學(xué)實驗動物中心。無菌小鼠飼育于無菌隔離器中，飼養(yǎng)環(huán)境為20 ℃～23 ℃，濕度為40%～70%，12 h光照，12 h黑暗。飼料和墊料均經(jīng)過60Co-γ50kGy射線輻照滅菌，飲水、鼠籠和飲水瓶等經(jīng)過高溫高壓滅菌后傳進無菌隔離器。10只無菌小鼠自由飲用濃度為0.01%的DEN液(A組)，另10只無菌小鼠在飲用同樣濃度DEN液的同時，每日腹腔注射一次脂多糖(0.1 mg/kg)(B組)。10只普通小鼠飲用同樣濃度的DEN液(C組)，另10只普通小鼠在飲用同樣濃度DEN液的同時，每日腹腔注射一次抗內(nèi)毒素IgY(1.6 mg/kg)(D組)。

1.3血漿內(nèi)毒素水平測定眼眶采血，分離血漿，按照試劑盒的方法用定量鱟試劑測定法檢測血漿內(nèi)毒素水平。

2結(jié)果

2.1肝癌發(fā)生率誘癌18周后，停用所有藥物24 h，第2天所有小鼠剖腹取肝臟，對懷疑肝癌的部位取肝組織做病理切片，結(jié)果肝癌發(fā)生率A組為0(0/9)，B組為66.7%(6/9)，C組為77.8%(7/9)，D組為12.5%(1/8)(表1，圖1)。取病理前，A、B、C、D四組小鼠分別死亡1、1、1、2只小鼠，死亡時間均發(fā)生在誘癌后的3～4周，死亡小鼠取病理未發(fā)現(xiàn)肝癌，考慮為DEN液中毒死亡。

2.2腫瘤數(shù)量發(fā)生肝癌的肝臟，肝癌常是散在多發(fā)，數(shù)目2～8個不等。其中C組9只小鼠發(fā)生肝癌數(shù)量最多，共有31個，各組肝癌數(shù)量見表1。

2.3腫瘤大小肝癌一般較小，多為米粒大小，直徑2.6～16 mm，各組肝癌平均直徑見表1。

2.4肝/體比肝臟重量與小鼠自體重量的比值，C組最高為11.3%，A組最低為5.2%，各組肝/體比見表1。

表1　血清內(nèi)毒素水平和肝癌發(fā)生情況

注：*與C組比較，P<0.01；#與B組比較，P<0.01；$與C組比較，P>0.05；Δ與D組比較，P<0.01。

2.5血清內(nèi)毒素水平肝癌發(fā)生率較高的B組和C組內(nèi)毒素水平最高，肝癌發(fā)生率較低的A組和D組內(nèi)毒素水平最低。

2.6血清內(nèi)毒素與肝癌發(fā)生情況的相關(guān)性各組的內(nèi)毒素水平與腫瘤數(shù)量、平均腫瘤直徑呈顯著正相關(guān)(r=0.875、0.812，P均<0.01)。

1A:A組肝臟有散在的細小結(jié)節(jié)，但沒有發(fā)現(xiàn)肝癌

1B:B組肝臟細小結(jié)節(jié)數(shù)量較多，多數(shù)動物出現(xiàn)肝癌，常有多個肝癌病灶并存于一個肝臟

1C:C組肝癌的發(fā)生率最高，常有多個肝癌病灶并存于一個肝臟

1D:D組肝癌發(fā)生率較低，該肝臟有兩個肝癌病灶。

圖1誘癌18周后各組肝臟的情況

3討論

資料表明[4]，誘發(fā)性肝癌動物模型中，以誘癌劑二乙基亞硝胺(DEN)的誘癌成功率較高，對肝臟致癌有較好的專一性，且大部分癌變?yōu)楦渭毎悄壳皯?yīng)用較廣泛的一種誘發(fā)性肝癌模型。

在致癌物的作用下腸道菌群的變化能誘發(fā)肝癌[5]，腸道有菌小鼠有很高的肝癌發(fā)生率，而腸道無菌小鼠極少出現(xiàn)肝癌[6]。我們的實驗表明，無菌小鼠(不僅僅腸道無菌)口服致癌物DEN后，未出現(xiàn)一例肝癌，而普通小鼠有很高的肝癌發(fā)生率，結(jié)合上面的資料，可以認為，細菌在肝癌的發(fā)生過程中起重要作用。該實驗表明。實驗之初也曾想過，由于無菌動物的免疫力低下，理論上講，無菌小鼠應(yīng)該更容易成癌，現(xiàn)在看來免疫力的高低不是引起肝癌的根本原因。

細菌在肝癌的發(fā)生過程中起重要作用，細菌的代謝產(chǎn)物內(nèi)毒素(一種脂多糖)在其中起何種作用。為此我們給無菌小鼠腹腔注射內(nèi)毒素，同樣喂食致癌物DEN液。18周后發(fā)現(xiàn)，無菌小鼠也誘導(dǎo)出肝癌，肝癌發(fā)生率與普通有菌小鼠的肝癌發(fā)生率相近，而且腫瘤數(shù)量、平均腫瘤直徑和肝/體比等均無明顯差異?？箖?nèi)毒素IgY作為LPS的特異性多克隆抗體，可有效拮抗LPS的生物學(xué)效應(yīng)[7]。本實驗中，對有菌小鼠腹腔注射抗內(nèi)毒素IgY同樣喂食DEN液后，只有一只小鼠產(chǎn)生肝癌。內(nèi)毒素水平的檢測也同樣表明，在內(nèi)毒素水平最高的B組和C組，肝癌發(fā)生率最高。而內(nèi)毒素水平最低A組和D組，肝癌發(fā)生率最低。統(tǒng)計學(xué)的相關(guān)性分析表明，各組內(nèi)毒素水平與腫瘤數(shù)量、平均腫瘤直徑呈顯著正相關(guān)。上述結(jié)果均表明，表面層次上看細菌是引起肝癌的重要因素，但不能排除細菌代謝產(chǎn)物內(nèi)毒素為引起肝癌的根本原因之可能。

部分文獻報道，[8]致癌物DEN在肝臟的代謝過程中引起DNA損傷，導(dǎo)致肝癌發(fā)生。但本次觀察發(fā)現(xiàn)，DEN在誘發(fā)肝癌的過程中必須有內(nèi)毒素的參與，沒有內(nèi)毒素的參與，單獨DEN難以誘發(fā)肝癌，因此不排除內(nèi)毒素在DEN 誘發(fā)肝癌的過程中起到重要作用，但其作用機理尚不清楚。

該實驗還發(fā)現(xiàn)在DEN誘發(fā)肝癌的過程中，無論是否產(chǎn)生肝癌，無菌動物肝臟的硬化程度較重而有菌動物的硬化程度較輕(圖1)，發(fā)生此現(xiàn)象原因尚不清楚，有待進一步研究。

總之，本研究表明，沒有細菌，就不會發(fā)生肝癌，而不排除細菌代謝產(chǎn)物內(nèi)毒素是引起肝癌的根本原因，可做為進一步揭開肝癌的發(fā)病機理等研究方法的新途徑之一。

參考文獻4

[1]郭云霞,王郁杰,朱瑩.幽門螺桿菌感染與胃癌的相關(guān)性探討[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志.2014,24(7): 1 700-1 701.

[2]吳兵,張崇移,李銘芬. 人乳頭狀瘤病毒感染與宮頸病變的相關(guān)性研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志.2013,23(10): 2 377-2 379.

[3]解玲玲,朱元民,劉玉蘭.特異性細菌感染與結(jié)直腸癌發(fā)病的關(guān)系[J].中華消化雜志. 2014,34(5): 359-360.

[4]Yoshiji H,Yoshii J,Ikenaka Y,et al.inhibition of reninangiontensin system attenuates liver enzyme-alreed preneoplastic lesions and fibrosis development in rats[J].J Hepatol,2002,37(1):22-30.

[5]Shin Yoshimoto,Tze mun Loo,Hiroaki Kanda,et al. Obesity-induced gut microbial metabolite promotes liver cancer through senescence secretome[J].Natrure,2013, 499：97-102.

[6]Dianne H.Dapito,Ali Mencin,Geum-Youn Gwak.er al.Promotion of hepatocellular carcinoma by th intestinal microbiota and TLR4[J]. Cancer Cell. 2012, 21(4):504-516.

[7]李強，張雅萍.抗內(nèi)毒索IgY 體外拮抗內(nèi)素效應(yīng)的實驗研究[J]．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2004，26(7)：610.

[8]Knasmuller S,Steinkellner H,Hirschl AM,et al.Impact of bacteria in dairy products and of the intestinal microflora on the genotoxic and carcinogenic effects of heterocyclic aromatic amines[J].Mutat Res,2001,480:129-138.

(收稿2015-06-21)

·論著·

3)重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科重慶400000

【摘要】目的探討內(nèi)毒素在二乙基亞硝銨(DEN)誘發(fā)小鼠肝癌過程中的作用。方法 四組雄性小鼠均喂食致癌物DEN液，A組為無菌小鼠，B組無菌小鼠腹腔注射內(nèi)毒素，C組為普通小鼠，D組普通小鼠腹腔注射抗內(nèi)毒素IgY。觀察肝癌發(fā)生率和血清內(nèi)毒素水平。結(jié)果內(nèi)毒素水平最高的B組和C組肝癌發(fā)生率最高，內(nèi)毒素水平最低的A組和D組肝癌發(fā)生率也最低，內(nèi)毒素水平和肝癌發(fā)生率呈顯著正相關(guān)。結(jié)論細菌的代謝產(chǎn)物內(nèi)毒素是引起肝癌的根本原因。

【關(guān)鍵詞】內(nèi)毒素; 細菌;二乙基亞硝銨; 肝癌

Role of endotoxin in pathogenesis of hepatocellular carcinoma in miceHanDianbing,ZengBenhua,GeChengguo.DepartmentofHepatobiliarySurgery,thePeople’sHospitalofRuzhouCity,RuhouHenan467500,China

【Abstract】ObjectiveTo explore the role of endotoxin in HCC induced by the DEN.MethodsFour groups of male mice were fed with DEN. Group A is the germ free mice, group B is also the germ free mice injected by endotoxin in abdominal cavity. group C is normal bacterial mice, group D is also normal bacterial mice injected by anti-endotoxin IgY in abdominal cavity.ResultsThe highest level of endotoxin in B group and C group had the highest incidence of hepatocellular carcinoma, the lowest level of endotoxin in A group and D group, the incidence of HCC is lowest. Endotoxin levels and the incidence of HCC was positively related.ConclusionEndotoxin is the root cause of liver cancer.

【Key words】Endotoxin;Bacteria;DEN;HCC

【中圖分類號】R-332

【文獻標識碼】A

【文章編號】1077-8991(2015)06-0001-03