王美蓉　黃衡宇云南中醫(yī)學(xué)院中藥材優(yōu)良種苗繁育工程研究中心，云南　昆明　650500

青葉膽不同交配方式種子的萌發(fā)研究

王美蓉黃衡宇*
云南中醫(yī)學(xué)院中藥材優(yōu)良種苗繁育工程研究中心，云南昆明650500

【摘要】青葉膽是我國(guó)特有的區(qū)域性藥用植物，現(xiàn)已處于瀕危狀態(tài).由于青葉膽分布區(qū)的片斷化，各小居群存在一定的自交或近交.為檢測(cè)交配方式對(duì)青葉膽種子的適合度影響，筆者以自交、近交、遠(yuǎn)交和自然結(jié)實(shí)種子為材料，在獲得自然結(jié)實(shí)種子最適萌發(fā)條件的基礎(chǔ)上，比較自交、近交、遠(yuǎn)交和自然結(jié)實(shí)種子的萌發(fā)率和萌發(fā)勢(shì).結(jié)果表明青葉膽種子萌發(fā)的最適條件為溫度25℃、100 mg/L GA3浸泡12h.在此條件下，其種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)分別達(dá)66. 25%和52. 13%.青葉膽4種不同交配方式種子萌發(fā)率和萌發(fā)勢(shì)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)青葉膽近交或自交的獲益可以補(bǔ)償與之相伴的座果率和結(jié)籽率折損.

【關(guān)鍵詞】青葉膽; GA3;發(fā)芽率;近交

Study on germination from the different mating patterns in Swertia mileensis

WANG Mei－rong HUANG Heng－yu*Engineering Research Center for Reproducing Fine Varieties of Chinese Medicinal Plants Yunnan University of Chinese Traditional Medicine，Kunming 650500，China

Abstract:Swetia mileensis is an endemic and medical plant in China and has been endangered．There are self－breed and inbreeding in small populations to some extent because of the fragment of habitat．The study using the seed for materials to explored the germination rate and germination potential after optimized the germination conditions on nature pollinating seeds in order to detect the fitness of seeds which includes self－breed，inbreeding，outbreeding and nature pollinating．Results indicated that the optimal condition for germination is cultured for 18h light kept at 25℃after soaked for 12h with 100mg/L GA3and the germination rate and germination potential is 66. 25% and 52. 13%．There was no significant difference between the germination rate and germination among different mating patterns，it could be preliminary predict that the profits from the inbreeding or self－breed could make up for the cost of the fruiting rate and seed setting rate．

Key words:Swertia mileensis; GA3; germination rate; inbreeding

青葉膽(Swertia mileensis T．N．Ho et W．L．Shi)為龍膽科(Gentianaceae)獐牙菜屬(Swertia．)多枝組一年生草本植物[1]，又名肝炎草、金魚膽和走膽草等，主要分布于云南紅河州的彌勒、開(kāi)遠(yuǎn)等地，是我國(guó)特有的一種珍稀藥材.在云南紅河哈尼族、彝族地區(qū)用于治療肝炎等疾病具有悠久的歷史.自上世紀(jì)70年代于民間發(fā)掘出來(lái)后即作為新的藥物資源被1974年版的《云南省藥品標(biāo)準(zhǔn)》以及1977～2010版的《中華人民共和國(guó)藥典》所收載[2].國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)青葉膽的研究主要集中在其化學(xué)成分及藥理活性方面[3－6]，表明青葉膽具有保肝、抗菌等多種藥理活性.李梅等[7]、劉建成等[8]分別對(duì)青葉膽種子發(fā)芽特性和萌發(fā)條件進(jìn)行了研究，表明青葉膽種子在野生條件下萌發(fā)率較低，光照、溫度和GA3處理能顯著提高其萌發(fā)率.

隨著青葉膽藥用價(jià)值的發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)近20年的濫采濫挖，野生居群已極為少見(jiàn)，加上生境不斷喪失和遭到破壞(如道路建設(shè)、開(kāi)荒、開(kāi)發(fā)沙場(chǎng)等)，青葉膽已呈零散形分布，片斷化明顯.由于大居群割裂為若干小居群后，隨之產(chǎn)生的遺傳漂變?cè)龃罅藗€(gè)體之間近交和自交的概率，可能產(chǎn)生近交或自交衰退[9－10].盡管青葉膽具鮮艷的花和顯著的腺體，并有一系列機(jī)制來(lái)保證其異花受粉，但在割裂的小生境中，其近交的概率不可避免加大，那么如果產(chǎn)生近交衰退，如何表現(xiàn)在后代種子的各項(xiàng)生活力指標(biāo)或這樣的衰退效應(yīng)是否表現(xiàn)在后代種子萌發(fā)率和萌發(fā)勢(shì)方面.筆者首先以自然結(jié)實(shí)種子為實(shí)驗(yàn)材料，結(jié)合前人[7，8]的研究結(jié)果，優(yōu)化青葉膽種子萌發(fā)條件;在此基礎(chǔ)上，考察自交、近交和遠(yuǎn)交種子在萌發(fā)率和萌發(fā)勢(shì)方面的表現(xiàn)，以期為青葉膽繁殖生物學(xué)提供有關(guān)種子適合度方面的資料.

1　材料與方法

1. 1材料材料來(lái)自云南省彌勒縣小蒼窩(24°15'32″N，103°29'60″E及附近，Alt: 1620m)，標(biāo)本經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院錢子剛教授鑒定為Swertia mileensis．，按表1，獲得自交、近交、遠(yuǎn)交及自然結(jié)實(shí)四種不同交配方式種子，常溫干燥后于4℃冰箱保存?zhèn)溆?

表1　青葉膽不同交配方式實(shí)驗(yàn)處理表

1. 2方法所用種子均置于4℃冰箱低溫后熟4個(gè)月.

1. 2. 1溫度對(duì)種子萌發(fā)的影響取自然結(jié)實(shí)種子，用0. 1% KMnO4溶液浸泡消毒20min，蒸餾水沖洗10 min洗凈，采用培養(yǎng)皿濾紙法培養(yǎng).一定的光照條件下(光強(qiáng)1800lx，光周期18h)[6]，溫度處理設(shè)置10℃、15℃、20℃、25℃、30℃5個(gè)溫度梯度，每組50粒種子，重復(fù)3次.每天觀察記錄種子萌發(fā)情況，適時(shí)適量添加蒸餾水，保持濾紙濕度.

1. 2. 2 GA3對(duì)種子萌發(fā)的影響取自然結(jié)實(shí)種子，分別用赤霉素GA3(50～200mg/L)及對(duì)照液(蒸餾水)浸種3h、6h、12h和24h，種子用蒸餾水洗凈，采用培養(yǎng)皿濾紙法進(jìn)行種子萌發(fā)，每組50粒種子，重復(fù)3次.培養(yǎng)溫度25℃，光照1800lx18h，每天觀察記錄種子萌發(fā)情況，適時(shí)添加蒸餾水，保持濾紙濕度.

1. 2. 3不同交配方式種子的萌發(fā)情況在前面實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定青葉膽種子萌發(fā)最適條件，取自交、近交、遠(yuǎn)交及自然結(jié)實(shí)4種交配方式種子用100 mg/L GA3浸泡12h，將種子用蒸餾水洗凈，采用培養(yǎng)皿濾紙法進(jìn)行種子萌發(fā)，每組50粒種子，重復(fù)3次.培養(yǎng)溫度25℃，光照1800lx18h，每天觀察記錄種子萌發(fā)情況，適時(shí)添加蒸餾水，保持濾紙濕度.

1. 2. 4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析所得數(shù)據(jù)采用SPSS12. 0軟件處理分析.萌發(fā)率=萌發(fā)種子數(shù)量/供試種子數(shù)量× 100%;發(fā)芽勢(shì)=種子發(fā)芽高峰期(10d)萌發(fā)種子數(shù)量/供試種子數(shù)量×100%.

2　結(jié)果與分析

2. 1溫度對(duì)種子萌發(fā)的影響由表2可見(jiàn)，青葉膽種子的萌發(fā)明顯受到溫度的影響.隨著溫度從10℃升高到25℃，發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)呈上升趨勢(shì)，當(dāng)溫度高達(dá)30℃，發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率則明顯下降.5組種子的始萌天數(shù)分別為20d，16d，11d，12d和15d.綜上，青葉膽在25℃時(shí)，發(fā)芽率高、萌發(fā)速度相對(duì)較快且發(fā)芽較一致.

2. 2 GA3對(duì)種子萌發(fā)的影響GA3對(duì)青葉膽種子萌發(fā)的影響見(jiàn)表3，經(jīng)不同質(zhì)量濃度的GA3浸泡不同時(shí)間后，其發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)有明顯改變.浸泡時(shí)間從3h增加到12h，發(fā)芽勢(shì)與發(fā)芽率隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，當(dāng)浸泡時(shí)間增至24h時(shí)，發(fā)芽勢(shì)與發(fā)芽率隨著質(zhì)量濃度的增加而下降.GA3濃度為100mg/L時(shí)，發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)出現(xiàn)最大均值，即浸泡12h時(shí)的66. 25%和52. 13%，第9d開(kāi)始萌芽到第19d發(fā)芽完畢，其發(fā)芽進(jìn)程最快，并且此條件下的發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)與其他處理存在顯著差異(P＜0. 05).因此用GA3處理青葉膽種子的最適條件為100mg/L浸泡12h.

2. 3不同交配方式種子的萌發(fā)情況青葉膽不同交配方式種子萌發(fā)情況見(jiàn)表4，在用100mg/L GA3浸泡12h后，經(jīng)過(guò)25℃光照18 h的恒溫保濕培養(yǎng)，青葉膽自交、近交、遠(yuǎn)交及自然結(jié)實(shí)(對(duì)照組)種子各自的發(fā)芽勢(shì)與發(fā)芽率普遍維持在64%和50%左右，4種交配方式種子間不存在顯著性差異(P＞0. 05).

表2　不同溫度對(duì)青葉膽種子萌發(fā)的影響

表3　GA3對(duì)青葉膽種子萌發(fā)的影響

表4　青葉膽不同交配方式種子萌發(fā)情況

3　討論

青葉膽原產(chǎn)地為云南東南部，此地屬典型的亞熱帶季風(fēng)氣候，干濕季明顯.根據(jù)本課題組的調(diào)查，青葉膽生活史始于云南降水量集中的7、8月份，12月份蒴果成熟，以后面臨長(zhǎng)達(dá)半年的旱季直至下一季的雨季來(lái)臨，因而青葉膽種子存在休眠期，這與胚胎學(xué)組織切片證明其種子成熟時(shí)胚僅發(fā)育至球形胚階段相吻合.本文研究結(jié)果表明，GA3處理對(duì)青葉膽種子萌發(fā)具顯著效應(yīng)，其萌發(fā)的適宜溫度為25℃，經(jīng)質(zhì)量濃度100mg/L GA3處理12h后，發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)明顯提高.

通過(guò)對(duì)青葉膽自交、近交、遠(yuǎn)交和自然結(jié)實(shí)種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)表明，在相同條件下，4種不同來(lái)源種子在萌發(fā)率和萌發(fā)勢(shì)方面無(wú)顯著性差異，結(jié)合無(wú)菌條件下4種交配方式后代植株在脫分化與再分化能力上亦無(wú)顯著性差異(另文發(fā)表)的結(jié)果，筆者初步推測(cè)自交和近交為片斷化的青葉膽居群提供了繁殖保障，即在缺乏長(zhǎng)距離傳粉昆蟲(chóng)的環(huán)境中，自交和近交保證了青葉膽種子的產(chǎn)生，其折損可能僅發(fā)生在座果率和結(jié)籽率上，這種現(xiàn)象是否暗示青葉膽彌勒居群可能由于割裂的片段化而缺乏有效的、長(zhǎng)距離的傳粉昆蟲(chóng)而導(dǎo)致其繁育系統(tǒng)進(jìn)化為自花受粉，還有待于來(lái)自傳粉生物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科的研究來(lái)證實(shí).

參考文獻(xiàn)

[1]中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)．中國(guó)植物志(62卷)[M]．北京:科學(xué)出版社，1988: 392．

[2]國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典2010年版(一部)[S]．北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010: 146．

[3]任凌燕，李隆云，秦松云．國(guó)產(chǎn)獐牙菜屬藥用植物的研究進(jìn)展[J]．重慶中草藥研究，2001，(44): 42－46．

[4]梁慶桑．青葉膽抗肝炎黃酮成分的研究[J]．中草藥通訊，1997，10: 1．

[5]湖南醫(yī)藥工業(yè)研究所．齊墩果酸治療急性黃疸型肝炎的療效及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的組織學(xué)初步觀察[J]．中草藥通訊，1997，4: 32．

[6]汪鋆植，葉紅，韓麗，等．青葉膽代替川東獐牙菜初探[J]．中藥材．1998，21(11): 545－547．

[7]李梅，尹明權(quán)，趙磊，等．青葉膽種子發(fā)芽特性的研究[J]．云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，20(4): 593－596．

[8]劉建成，劉冰，陳先玉．青葉膽種子萌發(fā)的研究[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(24): 10506－10507．

[9]Young AG．，Brown AHD．．Comparison population structure of the rare woodland shrub Daviesia suaveolens and its common congener D．mimosoides[J]．Conservation Biology，1996，10: 1220－1228．

[10]Frankham R，Ballou JD and Briscoe D．A．．Introduction to Conservation Genetics[M]．Cambridge: Cambridge University Press，2002: 121－136．

收稿日期:( 2014. 10. 10)

通信作者:黃衡宇，副教授，主要從事藥用植物發(fā)育生物學(xué)教學(xué)和科研工作，E－mail: hhyhhy96@163. com

作者簡(jiǎn)介:王美蓉，碩士研究生，主要從事藥用植物分子生物學(xué)研究.

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(31260077);云南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(2012Z005);湖南省高校創(chuàng)新平臺(tái)開(kāi)放項(xiàng)目(11K053).

【文章編號(hào)】1007－8517(2015)02－0010－03

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【中圖分類號(hào)】R282. 2