王明國，王向鵬，楊智勇，段奎甲，宋曉斌，鄧興力

(昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，昆明650032)

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人腦膠質瘤組織ABCG2蛋白的表達變化及其意義

王明國，王向鵬，楊智勇，段奎甲，宋曉斌，鄧興力

(昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，昆明650032)

摘要：目的觀察人腦膠質瘤組織中ABCG2蛋白的表達變化，并探討其意義。方法采用免疫組織化學法檢測59例份人腦膠質瘤組織，5例份正常腦組織中的ABCG2蛋白，并分析其與腦膠質瘤患者年齡、性別、病理分級、腫瘤部位臨床病理參數的關系。結果人腦膠質瘤組織ABCG2蛋白陽性細胞百分比為19.27%±16.80%，正常人腦組織為0，兩者比較，P<0.05。WHO Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級人腦膠質瘤組織中ABCG2蛋白陽性細胞百分比分別為6.40%±2.77%、11.13%±8.69%、17.25%±10.90%、31.94%±20.32%，WHO Ⅲ、Ⅳ級與WHO Ⅰ、Ⅱ 級比較，P<0.05。年齡≤45歲、>45歲者ABCG2蛋白陽性細胞百分比分別為15.02%±12.07%、25.06%±20.52%，兩者比較，P<0.05。結論 ABCG2蛋白在人腦膠質瘤組織高表達，其表達與腫瘤病理分級、年齡有關，可能有助于判斷膠質瘤生物學行為、預后、化療效果。

關鍵詞：腦腫瘤；膠質瘤；ABCG2蛋白

腦膠質瘤多呈高度浸潤性生長，預后較差，極易復發(fā)。手術仍是腦膠質瘤最主要的治療方式，術后常需輔助化療，但隨著腫瘤多藥耐藥性(MDR)的出現，化療藥物作用的敏感性降低，而化療抵抗是引起患者預后不良的重要因素之一[1,2]。因此，探索膠質瘤MDR的相關作用機制及其有效逆轉策略成為腦腫瘤研究的熱點[3]。研究發(fā)現，ABCG2在多種耐藥腫瘤細胞株中過度表達，提示ABCG2作為一種半分子轉運蛋白，在腫瘤化療的多藥耐藥中具有重要作用。本研究觀察了人膠質瘤組織中ABCG2蛋白的表達變化，并探討其意義。

1材料與方法

1.1組織標本人膠質瘤組織標本來自昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經外科2014年6月～2015年6月手術切除并經病理診斷確定的59例份膠質瘤組織，標本收集前均經患者及家屬同意，術前均未行任何其他輔助治療。59例患者中男28例、女31例，年齡14～77歲、中位年齡46歲。WHO病理分級Ⅰ級11例、Ⅱ級9例、Ⅲ級19例、Ⅳ級20例。另收集取自本科室各種手術入路及手術減壓術中切除的正常腦組織標本5例份作為對照。

1.2主要試劑小鼠抗人ABCG2單克隆抗體(美國abcam公司)；Super Vision超敏兩步法免疫組化試劑盒，DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程公司)。

1.3ABCG2蛋白檢測方法采用免疫組化染色法。所有組織標本經4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后作5 μm厚組織切片。組織切片經二甲苯、梯度乙醇脫蠟水化，并進行抗原熱修復，3% H2O2滅活內源性過氧化物酶活性，5% BSA封閉后，滴加稀釋好的ABCG2于4 ℃孵育過夜，次日用PBS漂洗數次后，滴加聚合HRP標記IgG。DAB試劑盒顯色5～10 min(光學顯微鏡下控制顯色程度)，脫水、透明、封片后觀察。PBS代替一抗作空白對照。染色結果判定標準：ABCG2主要表達于細胞膜，部分表達于細胞質，染成棕褐色。于低倍光學顯微鏡下(×100)尋找細胞陽性區(qū)域后，在高倍鏡(×400)下分別計數隨機5個視野中的平均陽性細胞數和細胞總數，以平均陽性細胞數與平均細胞總數的比值百分比計算ABCG2蛋白陽性細胞百分比。

2結果

人腦膠質瘤組織ABCG2蛋白陽性細胞百分比為19.27%±16.80%，正常人腦組織為0，兩者比較，P<0.05。ABCG2陽性細胞在腦膠質瘤中呈非均勻分布，部分區(qū)域可見陽性細胞密度較高，聚集分布，陽性細胞形態(tài)不規(guī)則，大小不一致，有時可見陽性細胞成條索狀排列、類似毛細血管的結構。ABCG2蛋白表達與腦膠質瘤臨床病理參數的關系見表1。WHO Ⅲ、Ⅳ級較WHO Ⅰ、Ⅱ級人腦膠質瘤組織中ABCG2蛋白陽性細胞百分比高(P<0.05)。年齡>45歲者較年齡≤45歲者ABCG2蛋白陽性細胞百分比高(P<0.05)。

表1　 ABCG2蛋白表達與腦膠質瘤臨床病理

3討論

惡性膠質瘤是我國最常見的腦腫瘤之一，其預后極差，嚴重威脅人類的生命健康。目前手術仍是其最主要的治療方式，結合分子靶向治療及同步放化療的綜合治療策略在膠質瘤的診療中顯現出明顯優(yōu)勢[4,5]。然而腫瘤的化療耐藥限制了惡性腫瘤患者的首次治療效果，一線治療方案失敗后的補救治療效果亦很差[6,7]。與其他各部位腫瘤化療一樣，腫瘤細胞對抗癌化療藥物的多藥耐藥是腦惡性腫瘤化療效果差的最重要原因。

Zhou等[8]報道，ABCG2基因可以作為一種通用的干細胞鑒定標志物。且已有大量研究表明，在腫瘤組織中也存在著腫瘤干細胞并攜有ABCG2半轉運體的表達，相關ABCG2半轉運體在腫瘤干細胞中的生物學功效研究已成為近年癌癥治療研究中的熱點問題[9]。研究主要集中于ABCG2腫瘤干細胞的分選功能及其多藥耐藥功能[10,11]。將該基因轉染非耐藥的乳腺癌細胞株，轉染細胞獲得了與耐藥細胞株MCF-7/AdrVp相似的耐藥特征，對甲氨蝶呤、米托蒽醌、柔紅霉素、阿霉素拓撲替康及其半合成物耐藥[3,12]。腫瘤干細胞或腫瘤中的側群細胞因表達ABCG2而產生耐藥的生物學特性，導致術后化療效果極差，是惡性腫瘤難以根除的原因之一[13]．

本研究結果顯示，正常人腦組織中未見ABCG2蛋白表達，而在各分級膠質瘤組織中均有不同程度的表達，且病理分級WHO Ⅲ、Ⅳ級較WHO Ⅰ、Ⅱ級人腦膠質瘤組織中ABCG2蛋白陽性細胞百分比高。而只有處于干細胞階段的細胞才表達ABCG2，提示病理分級高的膠質瘤組織存在更多的腦腫瘤干細胞，其臨床侵襲性更高，患者出現化療耐藥的可能性較大，與儲亮等[14]的研究結果一致。在本研究中，ABCG2免疫陽性細胞呈條索狀排列，部分區(qū)域可見陽性細胞密度較高，聚集分布。提示腦膠質瘤的發(fā)生可能是以少數的腦腫瘤干細胞為生發(fā)根源，逐漸增殖分化并向臨近微環(huán)境遷移整合，歷經此生物學過程，大量腦腫瘤干細胞分化成腫瘤細胞，僅少數細胞仍保持其干細胞特性。術后殘存的腫瘤干細胞可通過自我更新及多分化潛能，在人腦膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)、耐藥過程中起關鍵作用。此外，本研究還發(fā)現人腦膠質瘤中ABCG2的表達與患者的性別、腫瘤生長部位無關，而與患者的年齡密切相關，提示ABCG2的高表達可能源于細胞基因突變在腦腫瘤干細胞內的長期積累。以上研究結果提示，腦腫瘤干細胞使腫瘤具有對周圍腦組織的侵潤能力和對放化療的抵抗性，是腦膠質瘤高致死率和高復發(fā)率的根源。

相關研究[15]結果表明，黑色素瘤細胞中ABCG2的異常表達是細胞對Vemurafenib出現耐藥的重要分子機制之一，在人黑色素瘤A375細胞中敲低ABCG2可顯著改善Vemurafenib的藥物敏感性，證實ABCG2異常表達是機體對靶向藥物產生耐藥反應的重要分子機制之一。因此，有可能通過干預ABCG2在腫瘤干細胞中的表達來調控腫瘤干細胞增殖分化從而達到治愈癌癥的目的。ABC轉運蛋白抑制劑能夠增加化療藥物在腦內的積累。gefitinib的口服給藥能夠增加topotecan在神經系統(tǒng)膠質瘤中的藥物濃度。這些研究都說明了通過抑制ABC跨膜轉運蛋白,能夠增高ABC轉運蛋白底物譜中的藥物穿過血腦屏障的概率,增加這些藥物在神經系統(tǒng)的積累,可用于治療神經系統(tǒng)疾病[16]。

綜上所述，人膠質瘤組織ABCG2蛋白表達增高，其表達與腫瘤病理分級、年齡有關。深入探究ABCG2的表達與腫瘤MDR及與腫瘤干細胞分化調控的相關作用機制[17]，將會對尋找新的癌癥治療策略提供新思路。ABCG2蛋白可能有助于判斷膠質瘤生物學行為、預后、化療效果，并可作為生物靶向治療的有效靶點。

參考文獻：

[1] Weiler M, Blaes J, Pusch S, et al. mTOR target NDRG1 confers MGMT-dependent resistance to alkylating chemotherapy[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2014,111(1):409-414.

[2] S?rensen MD, Fosmark S, Hellwege S, et al. Chemoresistance and chemotherapy targeting stem-like cells in malignant glioma[J]. Adv Exp Med Biol, 2015,853:111-138.

[3] 孫臻峰,沈斌,張佳,等.耐藥基因MDR1(P-gp)和ABCG2在Hep-2細胞耐藥中的作用研究[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2015,29(11):1016-1019.

[4] Nakano I. Stem cell signature in glioblastoma: therapeutic development for a moving target[J]. J Neurosurg, 2015,122(2):324-330.

[5] 王小剛,吳國斌,袁紹紀,等.大腦膠質瘤病研究現狀[J].臨床神經外科雜志,2014,11(6):478-480.

[6] Quezada C, Garrido W, Oyarzún C, et al. 5′-ectonucleotidase mediates multiple-drug resistance in glioblastoma multiforme cells[J]. J Cell Physiol, 2013,228(3):602-608.

[7] Noguchi K, Katayama K, Sugimoto Y. Human ABC transporter ABCG2/BCRP expression in chemoresistance: basic and clinical perspectives formolecular cancer therapeutics[J]. Pharmgenomics Pers Med, 2014,7:53-64.

[8] Bruttel VS, Wischhusen J. Cancer stem cell immunology: key to understanding tumorigenesis and tumor immune escape[J]. Front Immunol, 2014,5:360.

[9] Blaylock RL. Cancer microenvironment, inflammation and cancer stem cells: A hypothesis for a paradigm change and newtargets in cancer control[J]. Surg Neurol Int, 2015,6:92.

[10] Chen Z, Liu F, Ren Q, et al. Suppression of ABCG2 inhibits cancer cell proliferation[J]. Int J Cancer, 2010,126(4):841-851.

[11] Szepesi A, Matula Z, Szigeti A, et al. ABCG2 is a selectable marker for enhanced multilineage differentiation potential in periodontal ligament stemcells[J]. Stem Cells Dev, 2015,24(2):244-252.

[12] Jani M, Ambrus C, Magnan R, et al. Structure and function of BCRP, a broad specificity transporter of xenobiotics and endobiotics[J]. Arch Toxicol, 2014,88(6):1205-1248.

[13] Ciurea ME, Georgescu AM, Purcaru SO, et al. Cancer stem cells: biological functions and therapeutically targeting[J]. Int J Mol Sci, 2014,15(5):8169-8185.

[14] 儲亮,黃強,張全斌,等.腦腫瘤干細胞耐藥基因ABCG2的實驗研究[J].中國藥學雜志,2009,57(10):754-758.

[15] Wu CP, Sim HM, Huang YH, et al. Overexpression of ATP-binding cassette transporter ABCG2 as a potential mechanism of acquired resistance tovemurafenib in BRAF(V600E) mutant cancer cells[J]. Biochem Pharmacol, 2013,85(3):325-334.

[16] Sanchez-Covarrubias L, Slosky LM, Thompson BJ, et al. Transporters at CNS barrier sites: obstacles or opportunities for drug delivery[J]. Curr Pharm Des, 2014,20(10):1422-1449.

[17] Castillo V, Valenzuela R, Huidobro C, et al. Functional characteristics of cancer stem cells and their role in drug resistance of prostate cancer[J]. Int J Oncol, 2014,45(3):985-994.

收稿日期：(2015-11-02)

通信作者：鄧興力

基金項目：云南省自然科學基金(2007C244M)；云南省衛(wèi)生廳科研 (2012ws0024)。

中圖分類號：R739.41

文獻標志碼：B

文章編號：1002-266X(2015)47-0038-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.47.014