張廣慧，　曹雪萍，　俞　靜，　劉　瑛，　葛　艷

(1. 同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院檢驗科，上海 200092)

摘要：目的　了解耐碳青霉烯類抗菌藥物的鮑曼不動桿菌流行病學(xué)情況以及耐藥機制，幫助臨床合理使用抗菌藥物，為控制醫(yī)院感染提供依據(jù)。方法　收集耐碳青霉烯類抗菌藥物的鮑曼不動桿菌110株及敏感株6株，進行來源病區(qū)和標本種類的統(tǒng)計分析；應(yīng)用重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng)(REP-PCR)進行基因型分型；使用PCR檢測β-內(nèi)酰胺酶基因(OXA、IMP、VIM等)及外排泵編碼基因(adeA、adeB、adeC、adeJ、adeG)的攜帶情況；采用實時熒光定量PCR對比耐藥菌株與敏感菌株的外排泵基因表達量的差異。結(jié)果　110株菌株主要來自痰標本，重癥監(jiān)護病房(ICU)分離率最高； 所有菌株REP-PCR電泳圖譜分為A～G 7型，110株耐藥菌株均為A型，且均被檢測到含有OXA-23、OXA-51基因，均未檢測到含有OXA-24、OXA-58、IMP-1、IMP-2、VIM-1、VIM-2基因；外排泵編碼基因adeA、adeB、adeC、adeJ及adeG的陽性率均為100%；耐藥菌株外排泵編碼基因adeA、adeB、adeC表達量明顯高于敏感菌株。結(jié)論　耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的流行型別基本相同，均為A型，應(yīng)引起臨床醫(yī)護人員的高度重視；β-內(nèi)酰胺酶基因(OXA-23、OXA-51)的表達以及外排泵基因(adeA、adeB、adeC)的過度表達與其對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥性有關(guān)。

關(guān)鍵詞：鮑曼不動桿菌；β-內(nèi)酰胺酶；外排泵；重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng)；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

中圖分類號：

耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌臨床分離株的流行病學(xué)與耐藥機制研究

張廣慧1，曹雪萍2，俞靜2，劉瑛2，葛艷1

(1. 同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院檢驗科，上海 200092)

摘要：目的了解耐碳青霉烯類抗菌藥物的鮑曼不動桿菌流行病學(xué)情況以及耐藥機制，幫助臨床合理使用抗菌藥物，為控制醫(yī)院感染提供依據(jù)。方法收集耐碳青霉烯類抗菌藥物的鮑曼不動桿菌110株及敏感株6株，進行來源病區(qū)和標本種類的統(tǒng)計分析；應(yīng)用重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng)(REP-PCR)進行基因型分型；使用PCR檢測β-內(nèi)酰胺酶基因(OXA、IMP、VIM等)及外排泵編碼基因(adeA、adeB、adeC、adeJ、adeG)的攜帶情況；采用實時熒光定量PCR對比耐藥菌株與敏感菌株的外排泵基因表達量的差異。結(jié)果110株菌株主要來自痰標本，重癥監(jiān)護病房(ICU)分離率最高； 所有菌株REP-PCR電泳圖譜分為A～G 7型，110株耐藥菌株均為A型，且均被檢測到含有OXA-23、OXA-51基因，均未檢測到含有OXA-24、OXA-58、IMP-1、IMP-2、VIM-1、VIM-2基因；外排泵編碼基因adeA、adeB、adeC、adeJ及adeG的陽性率均為100%；耐藥菌株外排泵編碼基因adeA、adeB、adeC表達量明顯高于敏感菌株。結(jié)論耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的流行型別基本相同，均為A型，應(yīng)引起臨床醫(yī)護人員的高度重視；β-內(nèi)酰胺酶基因(OXA-23、OXA-51)的表達以及外排泵基因(adeA、adeB、adeC)的過度表達與其對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥性有關(guān)。

關(guān)鍵詞：鮑曼不動桿菌；β-內(nèi)酰胺酶；外排泵；重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng)；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)01-0053-05R446.5

文獻標志碼：碼：A

作者簡介：張廣慧，男，1969年生，學(xué)士，副主任技師，主要從事臨床生化檢驗和微生物學(xué)檢驗工作。

通訊作者：葛艷，聯(lián)系電話：021-65981591。

Abstract:ObjectiveTo understand the drug resistance mechanisms and epidemiology of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii in order to guide the rational use of antibiotics and to provide the reference for the control of nosocomial infections. MethodsA total of 116 Acinetobacter baumannii (110 carbapenem-resistant isolates and 6 carbapenem-sensitive isolates) isolated from clinical specimens were classified and analyzed according to endemic areas and specimen types. The isolates were analyzed by repetitive-sequence polymerase chain reaction (REP-PCR) for genotyping. Beta-lactamase genes (OXA, IMP, VIM and soon) and efflux pump-encoding genes (adeA, adeB, adeC, adeJ, adeG) were amplified by PCR. Real-time fluorescence quantitation PCR was performed to compare the expression level of the efflux pump-encoding genes in resistant and sensitive isolates. ResultsThe isolation rate of resistant isolates in intensive care unit (ICU) was the highest-level, and the isolates were mainly isolated from sputum. The genotype types of carbapenem-resistant and -sensitive Acinetobacter baumannii were classified into 7 categories by REP-PCR. All the carbapenem-resistant isolates were type A. OXA-23 and OXA-51 were positive in 110 carbapenem-resistant isolates. However, OXA-24, OXA-58, IMP-1, IMP-2, VIM-1 and VIM-2 could not be detected in all the isolates. The positive rates of the efflux pump-encoding genes (adeA, adeB, adeC, adeJ and adeG) were 100%. The expression level of efflux pump-encoding genes (adeA, adeB, adeC) in resistant isolates was significantly higher than that in sensitive isolates. ConclusionsThe main popular type of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii is type A. Clinical staff should pay attention to this phenomenon. The expression of OXA-23 and OXA-51 overexpression of adeA, adeB and adeC efflux pump-encoding gene may play an important role in carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii.

DOI[5]SHIBATA N, Y, YAMANE K, et al. PCR typing of genetic determinants for metallo-beta-lactamases and integrases carried by gram-negative bacteria isolated in Japan, with focus on the class 3 integron[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(12):5407-5413. 10.3969/j.issn.1673-8640.2015.01.013

收稿日期：(2014-10-09)

Epidemiology and resistance mechanism study of carbapenem-resistantAcinetobacterbaumanniiZHANGGuanghui1,CAOXueping2,YUJing2,LIUYing2,GEYan1.(1.TongjiUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200092,China; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,XinhuaHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200092,China)

Key words:Acinetobacterbaumannii; beta-lactamase; Efflux pump; Repetitive-sequence polymerase chain reaction; Real-time fluorescence quantitation polymerase chain reaction

鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)是一種非發(fā)酵、需氧的革蘭陰性球桿菌，是引起醫(yī)院感染的常見條件致病菌，它可以導(dǎo)致尿路感染、傷口感染、醫(yī)院獲得性肺炎等,嚴重威脅患者的生命[1]。最近幾年，引起醫(yī)院感染的多重耐藥鮑曼不動桿菌甚至是泛耐藥鮑曼不動桿菌逐漸增多，治療極為困難，嚴重感染或免疫力低下患者的感染率及死亡率都明顯增高[2]，其中最為重要的就是對碳青霉烯類抗菌藥物產(chǎn)生的耐藥。2012年中國CHINET調(diào)查顯示不動桿菌屬細菌對亞胺培南和美羅培南的敏感率分別為41.9%和37.9%。還有研究表明，碳青霉烯類耐藥的鮑曼不動桿菌感染使患者住院的額外成本明顯增高[3]。因此，了解鮑曼不動桿菌的流行病學(xué)情況和耐藥機制，有助于加強鮑曼不動桿菌感染的防控，保障廣大患者的生命安全和健康權(quán)益。

材料和方法

一、材料

1．菌株來源收集上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院2012年2月至2013年11月臨床分離的鮑曼不動桿菌共116株，其中對碳青霉烯類抗菌藥物(亞胺培南、美羅培南)耐藥的菌株110株，敏感株6株，全部菌株用Vitek 2 Compact(法國生物梅里埃公司)進行菌種鑒定及體外藥物敏感性分析。

2．儀器及試劑聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴增儀、臺式高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司；電泳儀、凝膠成像儀購自中國天能科技有限公司。熒光定量PCR擴增儀購自Agilent Stratagene公司； PCR擴增試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR GreenⅠ試劑盒均購自上海生工生物工程有限公司；DNA Marker、Loading buffer購自TAKARA公司；DNA染色液(SYBR Safe DNA Gel Stain)為美國Invitrogen公司產(chǎn)品。

二、方法

1．模板制備采用煮沸法提取細菌DNA。 取300 μL雙蒸水于離心管中，從血平板上刮取適量菌落制成菌懸液。100 ℃處理15 min，10 600×g離心5 min。上清液即為DNA模板，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2．重復(fù)序列(repetitive-sequence, REP)-PCR流行病學(xué)檢測引物P1:5′-IIIGCGCCGICATCA-GGC-3′，P2:5′-ACGTCTTATCAGGCCTAC-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中10×PCR Buffer 2.5 μL，滅菌雙蒸水 12.75 μL，2 mmol/L dNTPs mixture 5.0 μL，DNA模板 1 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各1.0 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，5 U/μL Taq酶0.25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性1 min，45 ℃退火1 min，65 ℃延伸8 min，進行循環(huán)35次；最后65 ℃延伸16 min。擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,通過凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相。條帶數(shù)目和位置完全相同者可判斷為同一基因型。

4．β-內(nèi)酰胺酶與外排泵基因檢測用PCR檢測OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58、IMP-1、IMP-2、VIM-1、VIM-2基因以及adeA、adeB、adeC、adeJ、adeG等外排泵編碼基因。各基因的擴增引物見表1，PCR反應(yīng)體系和擴增反應(yīng)參數(shù)參照試劑盒說明書。

5．外排泵基因表達量檢測選取20株耐藥株與6株敏感株，37 ℃肉湯培養(yǎng)至對數(shù)生長期，提取細菌總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA作為模板，采用SYBR GreenⅠ試劑盒進行實時熒光定量PCR并分析數(shù)據(jù)。將檢測所得各基因的Ct均值與相對應(yīng)的rpoB的Ct均值相減進行標準化，得到校準后的ΔCt值，再將耐藥菌株校準后的ΔCt值與敏感菌株校準后的ΔCt值相減得到ΔΔCt值，最后用2-ΔΔCt計算出耐藥菌株外排泵編碼基因的mRNA相對表達量。反應(yīng)體系配制及操作步驟參考試劑盒說明書。溶解曲線的峰單一、銳利說明所測Ct值可信。

參考文獻表1β-內(nèi)酰胺酶基因PCR擴增引物序列引物引物序列預(yù)期長度(bp)OXA-23P15'-GATCGGATTGGAGAACCAGA-3'501[4]P25'-ATTTCTGACCGCATTTCCAT-3'OXA-24P15'-GGTTAGTTGGCCCCCTTAAA-3'246[4]P25'-AGTTGAGCGAAAAGGGGATT-3'OXA-51P15'-TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3'353[4]P25'-TGGATTGCACTTCATCTTGG-3'OXA-58P15'-AAGTATTGGGGCTTGTGCTG-3'599[4]P25'-CCCCTCTGCGCTCTACATAC-3'IMP-1P15'-ACCGCAGCAGAGTCTTTGCC-3'587[5]P25'-ACAACCAGTTTTGCCTTACC-3'IMP-2P15'-GTTTTATGTGTATGCTTCC-3'678[5]P25'-AGCCTGTTCCCATGTAC-3'VIM-1P15'-AGTGGTGAGTATCCGACAG-3'261[5]P25'-ATGAAAGTGCGTGGAGAC-3'VIM-2P15'-ATGTTCAAACTTTTGAGTAAG-3'801[5]P25'-CTACTCAACGACTGAGCG-3'adeAP15'-GGGTGTGAT-TCAAAAGAAGTCGC-3'169[6]P25'-GAACCTTTTCAATGATACCTC-CG-3'adeBP15'-AAAGACTTCAAAGAGCGGAC-TA-3'623[7]P25'-TCACGCATTGCTTCACCC-3'adeCP15'-ACAATCGTATCTCGTGGACTC-3'361[6]P25'-TAGAAACTGGGTTATTGGGGT-3'adeJP15'-CCTATTGCACAATATCCAACGA-3'119[8]P25'-AGGATAAGTCGCAGCAATCG-3'adeGP15'-GTCCTGAAATGGTCGTTCGT-3'143[8]P25'-AGCTTCTGCTTGGCTAGATGA-3'rpoBP15'-TTCATCTAGCCAAGCAGAAG-3'200[9]P25'-CCTGCTAATGGTAGGGTTAAG-3'

結(jié)果

一、標本種類及來源統(tǒng)計分析

耐藥菌株主要來源于痰標本，重癥監(jiān)護病房(intensive care unit，ICU)(包括外科ICU、急診ICU等)分離率最高，達44.5%。見表2。

表2　耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌分類統(tǒng)計

二、流行病學(xué)基因分型

110株耐藥鮑曼不動桿菌經(jīng)REP-PCR擴增后，呈現(xiàn)出大約7個條帶。110株耐藥株均為同一型別，稱之為A型，6株敏感株則為另外6種類型，分別為B、C、D、E、F、G型。見圖1。

三、β-內(nèi)酰胺酶和外排泵基因檢測

110株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌經(jīng)PCR檢測發(fā)現(xiàn)OXA-23和OXA-51基因陽性率均為100%，所有菌株均未檢測到OXA-24、OXA-58、IMP-1、IMP-2、VIM-1、VIM-2基因。外排泵基因檢測顯示20株耐藥菌和6株敏感菌株中adeA、adeB、adeC、adeJ、adeG的陽性率均為100%。見圖2、圖3。

四、外排泵基因表達量的檢測

20株耐藥菌株和6株敏感菌株，用實時熒光定量PCR比較耐藥菌株和敏感菌株基因表達量的差異。結(jié)果顯示耐藥菌株adeA、adeB、adeC的表達量顯著高于敏感菌株，分別達到18.2、14.2、15.1倍。見圖4。

注：M1為Wide Range DNA Marker(100~6 000 bp)；M2為λ-HindⅢ；A~G為基因型，A型1～14、17～20， B型15，C型16，D型21，E型22，F(xiàn)型23，G型24

圖1鮑曼不動桿菌REP-PCR指紋圖譜

注：M為DNA Marker DL2000；1、2為OXA-23陽性結(jié)果,3為陰性對照；4、5為OXA-51陽性結(jié)果,6為陰性對照

圖2β-內(nèi)酰胺酶基因電泳圖譜

注： M為DNA Marker DL2000；1、2為rpoB陽性結(jié)果，3為陰性對照；4、5為adeC陽性結(jié)果,6為陰性對照；7、8為adeB陽性結(jié)果,9為陰性對照；10、11為adeA陽性結(jié)果,12為陰性對照

圖3外排泵基因電泳圖譜

圖4　耐藥鮑曼不動桿菌的外排泵編碼基因相對表達量

討論

鮑曼不動桿菌是引起醫(yī)院感染的重要條件致病菌之一，其生存條件簡單，分布范圍廣，非常容易在醫(yī)院內(nèi)流行，尤其在ICU中，其感染率有明顯上升趨勢[10]。ROCA等[11]在5個洲的75個國家進行了ICU感染的病原菌研究，鮑曼不動桿菌被列為最常見病原體的第5位。近年來，由于抗菌藥物的廣泛使用，醫(yī)院感染鮑曼不動桿菌臨床分離株出現(xiàn)多重耐藥甚至是泛耐藥的特征，給臨床治療帶來極大困難。準確的種屬鑒定、藥物敏感性情況和基因分型對指導(dǎo)臨床控制多重耐藥菌的感染以及合理、有效地使用抗菌藥物具有重大臨床意義。

分析細菌同源性的方法有很多，脈沖場凝膠電泳是目前國際上公認的進行基因同源性分析的金標準方法，但該方法操作繁瑣，不便用于大樣本的分析。本研究采用基因組間重復(fù)非編碼序列分型法(REP-PCR)對細菌的同源性進行分析，敏感性好，操作簡單。結(jié)果顯示新華醫(yī)院內(nèi)耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌以A型克隆播散為主，而敏感菌株的6種克隆型均與A型相差較大，說明可能有耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌暴發(fā)流行，需要引起臨床醫(yī)護人員的高度重視，已報告新華醫(yī)院感染控制科采取相關(guān)措施，加強鮑曼不動桿菌感染的防控，防止其在醫(yī)院內(nèi)繼續(xù)流行傳播。統(tǒng)計分析顯示本研究耐藥鮑曼不動桿菌主要來源于痰液，且ICU的分離率最高。有研究表明鮑曼不動桿菌感染的危險因素包括嚴重的基礎(chǔ)疾病、長時間住院、機械通氣、留置導(dǎo)管、使用免疫抑制藥物、前期經(jīng)驗性抗菌藥物使用不當?shù)萚12-13]。ICU中的患者住院時間長，基礎(chǔ)疾病嚴重，多數(shù)帶有呼吸機、留置管或引流管，與上述危險因素相符。

引起鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的機制主要有4種：(1)β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生；(2)外膜蛋白表達的下調(diào)或缺失；(3)青霉素結(jié)合蛋白的改變；(4)細菌膜上主動外排泵表達增強，將透入細菌的藥物泵出菌體外。其中，β-內(nèi)酰胺酶包括苯唑西林水解酶和金屬酶，主要是OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58類酶和VIM、IMP等金屬酶。外排泵表達增強也是鮑曼不動桿菌產(chǎn)生多重耐藥的重要原因。RND型外排泵是研究最深入的、在鮑曼不動桿菌中被發(fā)現(xiàn)的外排泵家族，AdeABC、AdeIJK、AdeFGH均屬于RND型外排泵。有學(xué)者報道，AdeABC外排泵過度表達可導(dǎo)致細菌對氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類、四環(huán)素類、紅霉素、黏菌素及溴化乙錠產(chǎn)生耐藥；而AdeFGH可導(dǎo)致氯霉素、克林霉素、氟喹諾酮類、四環(huán)素類、磺胺類耐藥；AdeIJK可導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類、四環(huán)素類、氯霉素、噻肟單酰胺菌素類等耐藥[9, 14-15]。

本研究結(jié)果顯示，耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌臨床分離株以攜帶OXA-23、OXA-51型等D類酶為主，與彭俊華等[16]研究結(jié)果相符，所有菌株均未檢測到B類金屬酶(VIM-1、VIM-2、IMP-1、IMP-2)。另外，耐藥菌株的adeA、adeB、adeC外排泵基因表達量顯著高于敏感菌株，表明adeA、B、C型外排泵過度表達對新華醫(yī)院鮑曼不動桿菌多重耐藥性的產(chǎn)生有一定作用。β-內(nèi)酰胺酶基因(OXA-23、OXA-51)的表達以及外排泵基因(adeA、adeB、adeC)的過度表達是本研究耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的主要耐藥機制。

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(本文編輯：姜敏)