吳靜靜，　陸逸彬，　黃齊杰，　姚玉亭，　顧文莉

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200011)

口腔黏膜病外周血淋巴細(xì)胞亞群的觀察及分析

吳靜靜，陸逸彬，黃齊杰，姚玉亭，顧文莉

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200011)

摘要：目的觀察2種常見的口腔黏膜病——復(fù)發(fā)性阿佛他潰瘍(RAU)和口腔扁平苔蘚(OLP)患者外周血淋巴細(xì)胞亞群分類的變化，探討其免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制。方法用流式細(xì)胞術(shù)分析105例RAU患者、70例OLP患者和65名健康對(duì)照者的外周血淋巴細(xì)胞亞群(總T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、CD4+/CD8+、NK細(xì)胞、B細(xì)胞)，比較各指標(biāo)的組間差異。結(jié)果與健康對(duì)照組相比，RAU組總T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞顯著增加(P<0.05、P<0.01)，CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+比值和B細(xì)胞均顯著減少(P<0.01、P<0.001、P<0.05)；而OLP組與健康對(duì)照組相比，CD8+T細(xì)胞顯著降低(P<0.05)；RAU組的總T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞顯著高于OLP組(P<0.01、P<0.001))，而CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+比值和NK細(xì)胞均顯著低于OLP組(P<0.01、 P<0.001、P<0.05)。結(jié)論RAU和OLP患者多出現(xiàn)外周血淋巴細(xì)胞亞群百分率異常，細(xì)胞免疫功能紊亂，但二者的免疫狀態(tài)存在差異，因此針對(duì)性的免疫干預(yù)將成為一項(xiàng)極具潛力的治療措施。

關(guān)鍵詞：淋巴細(xì)胞亞群；外周血；口腔黏膜病；復(fù)發(fā)性阿佛他潰瘍；口腔扁平苔蘚

中圖分類號(hào)：

文章編號(hào)：1673-8640(2015)01-0036-04R446.63

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.01.009

Abstract:ObjectiveTo observe the changes of lymphocyte subsets of peripheral blood in 2 common oral mucosa diseases, recurrent aphthous ulcer (RAU) and oral lichen planus (OLP), and to investigate their immunological pathogenesis. MethodsBy flow cytometry, the lymphocyte subsets (total T cells, CD4+T cells, CD8+T cells, CD4+/CD8, NK cells and B cells) in the peripheral blood of patients with RAU (105 cases), OLP (70 cases) and healthy controls (65 cases). The difference was analyzed comparatively between the groups. ResultsCompared with healthy controls, total T cells and CD8+T cells in RAU group increased (P<0.05, P<0.01), but CD4+T cells, CD4+/CD8+and B cells decreased in RAU group (P<0.01, P<0.001, P<0.05). In addition, CD8+T cells in OLP group were lower than those in control group (P<0.05). The total T cells and CD8+T cells in RAU group were higher than those in OLP group (P<0.01, P<0.001), while CD4+T cells, CD4+/CD8+and NK cells in RAU group were significantly lower (P<0.01, P<0.001, P<0.05). ConclusionsOwing to the imbalanced lymphocyte subset percentages, the cellular immune function of patients with RAU or OLP is often found to be abnormal, but their immune states are not completely same. So, the application of selective immunologic intervention may be the promising therapeutic measure to those oral mucosa diseases.

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81101642)

作者簡(jiǎn)介：吳靜靜，女，1992年生，碩士，主要從事腫瘤的免疫與分子生物學(xué)檢驗(yàn)研究。

通訊作者：顧文莉，聯(lián)系電話: 021-23271699-5810。

收稿日期：(2014-05-15)

Observation and analysis on lymphocyte subsets of peripheral blood in oral mucosa diseasesWUJingjing,LUYibin,HUANGQijie,YAOYuting,GUWenli.(DepartmentofClinicalLaboratory,theNinthPeople′sHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200011,China)

Key words: Lymphocyte subset; Peripheral blood; Oral mucosa disease; Recurrent aphthous ulcer; Oral lichen planus

口腔黏膜病是臨床常見的口腔疾病，發(fā)病率高，病變種類繁多，病損復(fù)雜多樣，病程反復(fù)，嚴(yán)重影響患者的生活和工作，目前臨床治療以控制癥狀為主，難以根治，被列為口腔疾病的重大難題之一。該病致病因素眾多，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，迄今研究者普遍認(rèn)為機(jī)體免疫功能失衡在疾病發(fā)生、發(fā)展過程中占有重要地位，但病變類型不同，所涉及的免疫功能改變也不盡相同，治療措施迥異。我們以2種常見的口腔黏膜疾病——復(fù)發(fā)性阿佛他潰瘍(recurrent aphthous ulcer,RAU)和口腔扁平苔蘚(oral lichen planus, OLP)為例，比較相應(yīng)患者免疫功能的改變，探討其免疫發(fā)病機(jī)制的差異，為指導(dǎo)有效的臨床治療提供客觀依據(jù)。

材料和方法

一、病例選擇

本研究共設(shè)立3個(gè)觀察組：口腔黏膜病組(RAU組和OLP組)以及健康對(duì)照組。口腔黏膜病組來自2013年7至12月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔黏膜科就診的患者，參照《口腔黏膜病學(xué)》(第3版)中有關(guān)RAU和OLP的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)和病理特征確診，其中RAU組105例，男56例，女49例，年齡(43±13)歲；OLP組70例，男28例，女42例，年齡(47±12)歲。所有患者均排除其他自身免疫性疾病和長(zhǎng)期服藥的系統(tǒng)性疾病，且近3個(gè)月內(nèi)未曾接受任何免疫治療。健康對(duì)照組65名，男24名，女41名，年齡(43±10)歲，全部為上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院健康體檢者，無任何口腔黏膜疾病、自身免疫性疾病和其他長(zhǎng)期服藥的系統(tǒng)性疾病，且年齡及性別組成與口腔黏膜病組相似。

二、儀器試劑

BD FACSCalibur流式細(xì)胞分析儀和配套的Multitest IMK 試劑盒 (美國(guó)BD公司)。

三、方法

口腔黏膜病組和健康對(duì)照組病例均采集空腹靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸抗凝。取50 μL 抗凝全血分別加入20 μL CD3/CD8/CD45/CD4試劑和20 μL CD3/CD16CD56/CD45/CD19試劑，室溫避光孵育15 min后，各加入300 μL溶血素，再室溫避光孵育15 min，混勻，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。檢測(cè)指標(biāo)包括：總T淋巴細(xì)胞(CD3+)、輔助/誘導(dǎo)性T淋巴細(xì)胞(CD3+CD4+)、抑制/細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CD3+CD8+)、B淋巴細(xì)胞(CD3-CD19+)、NK細(xì)胞(CD3-CD16+CD56+)的分類百分率以及CD4+/CD8+細(xì)胞的比值。

四、 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果

與健康對(duì)照組相比，RAU組總T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞顯著增加(P<0.05、P<0.01)，CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+比值、B細(xì)胞顯著減少(P<0.01、P<0.001、P<0.05)；NK細(xì)胞雖有減少的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而OLP組與健康對(duì)照組相比，CD8+T細(xì)胞顯著降低(P<0.05)，；CD4+/CD8+比值雖有增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。RAU組的總T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞顯著高于OLP組(P<0.01、P<0.001)，而CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+比值和NK細(xì)胞顯著低于OLP組(P<0.01、P<0.001、P<0.05)。見表1和圖1。

表1不同口腔黏膜病患者外周血淋巴細(xì)胞亞群分類比較

組別例數(shù)總T細(xì)胞(%)CD4+T細(xì)胞(%)CD8+T細(xì)胞(%)CD4+/CD8+B細(xì)胞(%)NK細(xì)胞(%)健康對(duì)照組6567.11±7.5437.23±6.3426.51±6.901.53±0.5712.42±3.1418.95±7.05RAU組10570.10±7.72*34.29±6.80**30.35±8.00**1.24±0.55***11.13±3.71*17.88±7.93OLP組7066.14±9.90##38.29±8.73##23.31±6.77*###1.82±0.88###11.61±4.2921.07±10.10#

注：與健康對(duì)照組比較，*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001；與RAU組比較，#P<0.05、##P<0.01、###P<0.001

圖1　3組外周血淋巴細(xì)胞亞群分類比較

討論

RAU 是以復(fù)發(fā)性、周期性、自限性為特點(diǎn)的口腔黏膜灼痛性潰瘍，人群發(fā)病率高達(dá)20%，居口腔黏膜疾病的首位。其病因復(fù)雜，機(jī)制未明，但研究者普遍認(rèn)為免疫因素與RAU的發(fā)病密切相關(guān)。正常情況下，機(jī)體內(nèi)淋巴細(xì)胞各亞群之間保持一定比例，維持適度的免疫應(yīng)答。但在某種誘因作用下，免疫穩(wěn)態(tài)被破壞，造成局部免疫損傷，導(dǎo)致口腔潰瘍的發(fā)生。1969年研究者首次發(fā)現(xiàn)RAU患者病損處有大量T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，其中潰瘍前期和愈合期以CD4+T細(xì)胞為主，而潰瘍期則以CD8+T細(xì)胞為主，提示T淋巴細(xì)胞在RAU發(fā)病過程中存在異常的調(diào)節(jié)機(jī)制。而張華昌等[2]研究發(fā)現(xiàn)在RAU患者外周血中CD4+、CD8+T細(xì)胞及CD4+/CD8+變異率與正常組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

本研究結(jié)果顯示RAU患者體內(nèi)存在明顯的T淋巴細(xì)胞分類異常，如總T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞增加，CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+比值明顯減少。這種細(xì)胞亞群比例的失調(diào)，可引起全身或局部的免疫功能紊亂。如CHAVAN等[3]對(duì)RAU活檢組織做組化染色時(shí)發(fā)現(xiàn)，潰瘍期潰瘍局部CD8+T細(xì)胞占多數(shù)，這便是機(jī)體免疫狀態(tài)在局部的表現(xiàn)之一，結(jié)果是機(jī)體或局部細(xì)胞免疫功能受到影響，增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)各種非特異性和特異性致病因子的易感性，較易發(fā)生口腔黏膜上皮的完整性損傷，導(dǎo)致潰瘍產(chǎn)生。本研究印證了RAU患者體內(nèi)存在淋巴細(xì)胞亞群的比例失衡，而由此形成的免疫功能異?？赡苁荝AU發(fā)病過程的重要環(huán)節(jié)。此外，有研究者還發(fā)現(xiàn)，RAU患者潰瘍局部CD4+T細(xì)胞亞群功能也存在異常，Th1細(xì)胞活躍，導(dǎo)致其分泌的相關(guān)基因，如γ干擾素(interferon gamma，IFN-γ)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、白細(xì)胞介素15(interleukin，IL-15)等表達(dá)上調(diào)，而Th2細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)無明顯改變[4]，由此導(dǎo)致的局部免疫功能異常可能也參與RAU的發(fā)病過程。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)RAU組B細(xì)胞顯著減少，這與SISTIG等[5]的結(jié)果完全一致。據(jù)此推測(cè)在RAU患者體內(nèi)除了存在T細(xì)胞免疫功能異常外，B細(xì)胞主導(dǎo)的體液免疫功能也可能存在缺陷。吳慧華等[6]發(fā)現(xiàn)RAU患者唾液中SIgA的含量較正常組低。但相關(guān)研究結(jié)果不盡相同，MOHAMMAD等[7]發(fā)現(xiàn)RAU急性期唾液IgA水平顯著高于緩解期和健康對(duì)照人群，與SALUJA等[8]的報(bào)道類似。分析原因，可能如研究者所述，與臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)、選取病例的臨床分類及檢測(cè)方法的敏感性不同有關(guān)。鑒于機(jī)體全身或局部的適應(yīng)性免疫應(yīng)答都有可能受到不同程度的波及，若再加上某些誘因，如在病毒感染、精神緊張、疲勞、維生素或微量元素缺乏、激素水平改變等作用下，患者就會(huì)最終出現(xiàn)反復(fù)發(fā)作的口腔潰瘍。

至于NK細(xì)胞在RAU患者中的變化，主要反映固有免疫在RAU發(fā)病中的作用，至今文獻(xiàn)報(bào)道各不相同。SISTIG等[5]發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞活力在RAU急性期和緩解期均下降，而伍江慧等[9]則證實(shí)NK細(xì)胞活性在RAU發(fā)作期顯著提高。這些結(jié)果提示NK細(xì)胞的活性改變可能與RAU的發(fā)病有關(guān)。本研究主要關(guān)注NK細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與正常組間并無差異，但其活力如何變化還有待進(jìn)一步探討。

OLP也是一種常見的口腔黏膜慢性炎癥性疾病，其主要病理改變是基底細(xì)胞液化變性及上皮下淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，但發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。目前有研究者認(rèn)為OLP是一種由自身細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞引發(fā)上皮細(xì)胞凋亡所導(dǎo)致的慢性炎性疾病[10]。在OLP病損處浸潤(rùn)著大量的T淋巴細(xì)胞，且毗鄰受損基底細(xì)胞處的T淋巴細(xì)胞大部分為活性CD8+T細(xì)胞，而受損基底膜區(qū)域的CD4+T細(xì)胞并未增加[11]，而且由OLP損害區(qū)分離出的CD8+T細(xì)胞克隆顯示出了對(duì)自體同源角質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性[12]。提示激活的CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞可啟動(dòng)對(duì)基底膜角質(zhì)形成細(xì)胞的殺傷作用，最終導(dǎo)致口腔黏膜的損傷。

本研究主要關(guān)注OLP組患者外周血中T淋巴細(xì)胞亞群的變化，結(jié)果表明與健康對(duì)照組相比，OLP組CD8+T細(xì)胞顯著降低，這與PEKINER等[13]的報(bào)道一致。而其他如總T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+細(xì)胞比值均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。至于CD8+T細(xì)胞的減少，可能是由于大量具有免疫活性的CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞從循環(huán)血液轉(zhuǎn)移到損傷部位發(fā)揮效應(yīng)所致。而CD4+T細(xì)胞雖然量未發(fā)生變化，但其本身也是多組分的細(xì)胞群體，如Th1、Th2、Th17、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等，它們各自在OLP中的組成變化還有待進(jìn)一步研究。潘玉霞等[14]曾關(guān)注OLP與Th1/Th2平衡之間的關(guān)系，認(rèn)為患者體內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)格局發(fā)生變化，其中病損組織局部Th1型細(xì)胞因子占優(yōu)勢(shì)地位，而外周血中則以Th2型細(xì)胞因子為主，這可能與其發(fā)病機(jī)制有關(guān)。

目前有關(guān)OLP患者體內(nèi)淋巴細(xì)胞亞群變化的報(bào)道不斷出現(xiàn)，雖然結(jié)論不一致，但存在共同趨勢(shì)，即患者體內(nèi)大多存在淋巴細(xì)胞亞群分布或功能紊亂。至于結(jié)果間的差異，原因可能是選取研究對(duì)象間的差異，如病情輕重、病程長(zhǎng)短、疾病活躍程度、病變部位等。研究觀察指標(biāo)不同也會(huì)影響結(jié)果判斷，如細(xì)胞數(shù)量與活性之間的關(guān)系，因?yàn)橛袌?bào)道OLP患者外周血淋巴細(xì)胞亞群雖然數(shù)量減少，但活性仍能保持[13]。另外，不同的檢測(cè)方法也是造成結(jié)果差異的原因之一，如方法的敏感性、特異性、干擾因素及局限性等都可能影響最終的結(jié)果判斷。我們推測(cè)正是由于上述諸多原因造成本研究結(jié)果與其他研究結(jié)論[15-16]不盡相同。

眾所周知，RAU和OLP這2類常見的口腔黏膜病都和患者異常的免疫功能密不可分，但二者免疫狀態(tài)的變化趨勢(shì)及發(fā)病機(jī)制并不相同。本研究比較這2組患者外周血中淋巴細(xì)胞亞群，發(fā)現(xiàn)RAU組的總T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞顯著高于OLP組，而CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+比值和NK細(xì)胞顯著低于OLP組，結(jié)果印證了2種疾病所呈現(xiàn)的不同的免疫狀態(tài)。CD4+T細(xì)胞(即誘導(dǎo)性/輔助性T細(xì)胞)啟動(dòng)免疫反應(yīng)，CD8+T細(xì)胞(即抑制性/細(xì)胞毒性T細(xì)胞)調(diào)控免疫反應(yīng)，二者維持平衡可保證機(jī)體正常的免疫應(yīng)答；若比例異常，機(jī)體可出現(xiàn)免疫功能的紊亂和相應(yīng)的臨床癥狀。RAU患者體內(nèi)CD3+、CD4+及CD4+/CD8+比值偏低，這種免疫缺陷狀態(tài)可增加黏膜上皮對(duì)各種非特異性和特異性致病因子的易感性，導(dǎo)致潰瘍反復(fù)發(fā)作。而OLP發(fā)病機(jī)制則有所不同，目前普遍認(rèn)為它是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，在其發(fā)病過程中，抗原特異性機(jī)制和非特異性機(jī)制都有所涉及，其中T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用引發(fā)角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡被認(rèn)為是其發(fā)病機(jī)制中最主要的環(huán)節(jié)。

綜上所述，RAU與OLP患者體內(nèi)雖然都存在免疫功能的紊亂，但二者的免疫發(fā)病機(jī)制及病理變化不盡相同。本研究從外周血淋巴細(xì)胞亞群分類變化的角度，進(jìn)一步證實(shí)2種常見的口腔黏膜疾病存在各自特征性的免疫功能紊亂。因此在臨床治療時(shí)不能一概而論，必須根據(jù)患者不同的免疫狀態(tài)，有針對(duì)性地采取免疫干預(yù)措施，改善患者失衡的免疫狀態(tài)，以便取得更好的治療效果。

參考文獻(xiàn)

[1]陳謙明.口腔黏膜病學(xué)[M]. 3版. 北京:人民衛(wèi)生出版社,2008:58-68,101-107.

[2]張華昌,范小平,向?qū)W熔, 等. 復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍患者的T淋巴細(xì)胞免疫因素的研究[J]. 重慶醫(yī)學(xué),2010,39(10):1239-1240.

[3]CHAVAN M, JAIN H, DIWAN N, et al. Recurrent aphthous stomatitis: a review[J]. J Oral Pathol Med, 2012,41(8):577-583.

[4]LEWKOWICZ N, KUR B, KURNATOWSKA A, et al. Expression of Th1/Th2/Th3/Th17-related genes in recurrent aphthous ulcers[J]. Arch Immunol Ther Exp (Warsz), 2011,59(5):399-406.

[5]SISTIG S, CEKIC-ARAMBASIN A, RABATIC S, et al. Natural immunity in recurrent aphthous ulceration[J]. J Oral Pathol Med, 2001,30(5):275-280.

[6]吳慧華,王燕秋.ROU患者唾液和血清免疫球蛋白變化的觀察[J]. 臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2005,21(5):308-309.

[7]MOHAMMAD R, HALBOUB E, MASHLAH A, et al. Levels of salivary IgA in patients with minor recurrent aphthous stomatitis: a matched case-control study[J]. Clin Oral Investig, 2013,17(3):975-980.

[8]SALUJA R, KALE A, HALLIKERIMATH S. Deter-mination of levels of salivary IgA subclasses in patients with minor recurrent aphthous ulcer[J]. J Oral Maxillofac Pathol, 2012,16(1):49-53.

[9]伍江慧.復(fù)發(fā)性口腔潰瘍患者自然殺傷細(xì)胞活性的變化[J]. 口腔醫(yī)學(xué)研究, 2007,23(5): 559.

[10]SCULLY C, CARROZZO M. Oral mucosal disease: lichen planus[J]. Br J Oral Maxillofac Surg, 2008,46(1):15-21.

[11]ZHOU XJ, SUGERMAN PB, SAVAGE NW, et al. Intra-epithelial CD8+T cells and basement membrane disruption in oral lichen planus[J]. J Oral Pathol Med, 2002, 31(1):23-27.

[12]SUGERMAN PB, SATTERWHITE K, BIGBY M. Autocytotoxic T-cell clones in lichen planus[J]. Br J Dermatol, 2000,142(3):449-456.

[13]PEKINER FN, DEMIREL GY, BORAHAN MO, et al. Evaluation of cytotoxic T-cell activation,chemokine receptors, and adhesion molecules in blood and serum in patients with oral lichen planus[J]. J Oral Pathol Med, 2012,41(6):484-489.

[14]潘玉霞,蔡揚(yáng). 口腔扁平苔蘚與Th1/Th2平衡[J]. 臨床口腔醫(yī)學(xué)志, 2008,24(6):376-378.

[15]蕭燕,蕭卓然,李秉琦. 口腔扁平苔蘚患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的觀察[J]. 口腔醫(yī)學(xué),1991, 11(3):130-132.

[16]孫佩佩,楚芳芳,杜令倩,等.口腔扁平苔蘚患者外周血T細(xì)胞亞群水平變化及意義[J].山東醫(yī)藥, 2010,50(34):99.

(本文編輯：姜敏)