李　峰，　魏　群，　黃東鳳，　張　弘

(南通大學附屬醫(yī)院消化病研究室，江蘇 南通 226001)

摘要：目的　通過研究gp96、髓樣細胞白血病-1(Mcl-1)蛋白在肝硬化和肝癌組織中的表達及臨床病理學意義，初步探討其與肝硬化和肝癌發(fā)生、發(fā)展的關系。方法　采用免疫組織化學ENVISION法分別檢測19例肝硬化組織(癌旁肝硬化組織)、32例肝癌組織和21例對照肝組織(癌旁非硬化肝組織)中gp96、Mcl-1的表達，并分析其各自表達與肝癌臨床病理學特征的關系。取來源于同一患者的肝癌組織、癌旁肝硬化組織或癌旁非肝硬化組織，分別配對檢測gp96、Mcl-1，比較兩者的陽性表達率。結果　對照組、肝硬化組和肝癌組gp96陽性表達率逐漸遞增，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；gp96的陽性表達與腫瘤有無包膜、TNM分期有關(P<0.05)，與患者的性別、年齡、腫瘤大小、血清甲胎蛋白(AFP)值、組織學分級及臨床分期無關(P>0.05)。肝癌組和肝硬化組Mcl-1陽性表達率明顯高于對照組(P<0.05)，但肝癌組和肝硬化組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；Mcl-1陽性表達與腫瘤有無壞死和TNM分期有關(P<0.05)。肝癌組gp96陽性表達率明顯高于配對癌旁肝硬化組及配對癌旁非肝硬化組(P均<0.05)；而肝癌組Mcl-1陽性表達率明顯高于配對癌旁非肝硬化組，與配對癌旁肝硬化組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論　gp96、Mcl-1過表達可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展有關。gp96可能參與了肝硬化的發(fā)生、發(fā)展及向肝癌的惡性轉化，有助于判斷肝癌患者的預后。

關鍵詞：gp96；髓樣細胞白血病-1；肝細胞癌；肝硬化

中圖分類號：

gp96、Mcl-1在肝硬化和肝癌組織中表達及意義

李峰，魏群，黃東鳳，張弘

(南通大學附屬醫(yī)院消化病研究室，江蘇 南通 226001)

摘要：目的通過研究gp96、髓樣細胞白血病-1(Mcl-1)蛋白在肝硬化和肝癌組織中的表達及臨床病理學意義，初步探討其與肝硬化和肝癌發(fā)生、發(fā)展的關系。方法采用免疫組織化學ENVISION法分別檢測19例肝硬化組織(癌旁肝硬化組織)、32例肝癌組織和21例對照肝組織(癌旁非硬化肝組織)中gp96、Mcl-1的表達，并分析其各自表達與肝癌臨床病理學特征的關系。取來源于同一患者的肝癌組織、癌旁肝硬化組織或癌旁非肝硬化組織，分別配對檢測gp96、Mcl-1，比較兩者的陽性表達率。結果對照組、肝硬化組和肝癌組gp96陽性表達率逐漸遞增，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；gp96的陽性表達與腫瘤有無包膜、TNM分期有關(P<0.05)，與患者的性別、年齡、腫瘤大小、血清甲胎蛋白(AFP)值、組織學分級及臨床分期無關(P>0.05)。肝癌組和肝硬化組Mcl-1陽性表達率明顯高于對照組(P<0.05)，但肝癌組和肝硬化組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；Mcl-1陽性表達與腫瘤有無壞死和TNM分期有關(P<0.05)。肝癌組gp96陽性表達率明顯高于配對癌旁肝硬化組及配對癌旁非肝硬化組(P均<0.05)；而肝癌組Mcl-1陽性表達率明顯高于配對癌旁非肝硬化組，與配對癌旁肝硬化組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論gp96、Mcl-1過表達可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展有關。gp96可能參與了肝硬化的發(fā)生、發(fā)展及向肝癌的惡性轉化，有助于判斷肝癌患者的預后。

關鍵詞：gp96；髓樣細胞白血病-1；肝細胞癌；肝硬化

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)02-0185-06R446.1

文獻標志碼：碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.02.020

作者簡介：李峰，男，1977年生，碩士，主要從事消化系統(tǒng)腫瘤的研究。

通訊作者：張弘，聯(lián)系電話：0513-85052461。

Abstract:ObjectiveTo investigate the expressions and clinical pathological significance of gp96 and myeloid cell leukemia-1(Mcl-1) in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma tissues to study preliminarily their relationships with the genesis and progression development of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. MethodsThe expressions of gp96 and Mcl-1 were detected respectively by ENVISION immunohistochemistry in 19 liver cirrhosis tissues (liver cirrhosis tissues beside hepatocellular carcinoma), 32 hepatocellular carcinoma tissues and 21 control tissues (non-liver cirrhosis tissues beside hepatocellular carcinoma). Their relationships of expressions with clinical pathological characteristics of hepatocellular carcinoma were investigated. The expressions of gp96 and Mcl-1 of liver cirrhosis tissues beside hepatocellular carcinoma, hepatocellular carcinoma tissues and non-liver cirrhosis tissues beside hepatocellular carcinoma from one patient were detected, and the positive expression rates were compared. ResultsThe positive expression rate of gp96 increased gradually from control, liver cirrhosis to hepatocellular carcinoma groups, which showed significantly different (P<0.05). The positive expression of gp96 had relationships with tumor envelope and TNM staging(P<0.05), and there was no relationship with sex, age, tumor size, serum alpha-fetoprotein (AFP), histological grading and clinical staging (P>0.05). Mcl-1 positive expression in hepatocellular carcinoma and liver cirrhosis groups markedly increased compared to control group, respectively(P<0.05), and there was no statistical significance between liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma groups (P>0.05). The positive expression of Mcl-1 had relationships with tumor necrosis and TNM staging(P<0.05). The positive expression rate of gp96 in hepatocellular carcinoma group was significantly higher than those in liver cirrhosis and control groups (P<0.05). The positive expression rate of Mcl-1 in hepatocellular carcinoma group was higher than that in control group, and had no statistical significance with that in liver cirrhosis group (P>0.05). ConclusionsThe overexpressions of gp96 and Mcl-1 are related to the genesis and progression of hepatocellular carcinoma. The gp96 may implicate in the formation and development of liver cirrhosis as well as its subsequent malignant transformation, and may be used as a prognostic biomarker for hepatocellular carcinoma.

收稿日期：(2014-04-22)

Expressions and significance of gp96 and Mcl-1 in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma tissuesLIFeng,WEIQun,HUANGDongfeng,ZHANGHong.(DepartmentofGastroenterology,theAffiliatedHospitalofNantongUniversity,JiangsuNantong226001,China)

Key words: gp96； Myeloid cell leukemia sequence-1；Hepatocellular carcinoma；Liver cirrhosis

肝硬化是一種常見的慢性肝臟疾病，是由各種原因所致的肝纖維化進一步發(fā)展而來的不可逆性病變，其發(fā)病機制復雜。肝細胞癌(簡稱肝癌)是世界上最常見、惡性程度最高的腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤發(fā)病率的第5位、死因的第3位[1]。在我國，肝癌的死亡率僅次于肺癌[2]。流行病學調(diào)查顯示，肝硬化尤其是乙型肝炎后肝硬化是肝癌發(fā)生最重要的一個危險因素[3]，也是肝癌手術切除的一個主要限制因素。因此，阻斷肝硬化的發(fā)生、發(fā)展及早期預測癌變具有重要的臨床意義。gp96是存在于真核生物細胞內(nèi)質網(wǎng)中的相對分子質量為96 000的熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)，屬HSP90家族。髓樣細胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1，Mcl-1)是Bcl-2家族成員，因其半衰期短以及能被快速誘導表達和降解而在Bcl-2家族中具有獨特性。近年來，gp96、Mcl-1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和腫瘤治療中的作用越來越受到重視[4-5]。我們利用免疫組織化學方法(簡稱免疫組化)檢測gp96、Mcl-1蛋白在肝硬化和肝癌組織中表達，初步探討其與肝硬化和肝癌發(fā)生、發(fā)展以及與肝癌臨床病理學特點的關系。

材料和方法

一、一般資料

收集2010年5月至2012年5月南通大學附屬醫(yī)院病理科原發(fā)性肝癌組織石蠟包埋標本32例，均為肝細胞癌，其中男25例，女7例，平均年齡(51±15)歲，所有肝癌患者術前均未接受任何全身化療、放射治療、肝動脈栓塞和無水酒精注射等治療；肝硬化組織石蠟包埋標本19例(癌旁肝硬化組織)，其中男12例，女7例，平均年齡(50±11)歲；同時選取癌旁非硬化肝組織石蠟包埋標本21例作為對照組，其中男10例，女11例，平均年齡(45±14)歲。

二、方法

1.實驗方法大鼠抗人gp96單克隆抗體(1∶100)及小鼠抗人Mcl-1單克隆抗體(1∶50)為美國NeoMarkers公司產(chǎn)品。多聚-L-賴氨酸購自福州邁新生物技術開發(fā)公司；DAB試劑盒購自北京中山生物技術有限公司。免疫組織化學操作方法采用ENVISION法，4 μm石蠟切片，微波加熱法抗原修復，采用已知陽性細胞作陽性對照，采用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)代替一抗作為陰性對照。

2.結果判斷免疫組化染色的結果判斷經(jīng)兩名高年資病理醫(yī)師采用雙盲法閱片，以獲得統(tǒng)一結果為準。參照文獻[6]的標準，在200倍光學顯微鏡下隨機計數(shù)5個視野，統(tǒng)計陽性細胞所占百分比。統(tǒng)計計分從兩個方面進行評價。(1)染色陽性細胞數(shù)：<4%為0分，5%～24%為1分，25%～49%為2分，≥50%為3分；(2)染色強度：無細胞著色計0分，呈淡黃色著色計1分，呈棕黃色著色計2分，呈深褐色著色計3分。將每一例兩項得分相加即為該腫瘤細胞陽性表達得分。最低得分為0分，最高得分為6分；≤2分為陰性或弱表達，3～4分為中度陽性，5～6分為強陽性。 陽性表達包括中度陽性及強陽性。取來源于同一患者的肝癌組織、癌旁肝硬化組織或癌旁非肝硬化組織分別配對檢測gp96、mcl-1的陽性表達度。

三、統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。率的比較采用χ2檢驗或確切概率法，相關性分析采用Spearman等級相關。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、肝癌組、肝硬化組和對照組gp96、Mcl-1的表達

gp96陽性表達物呈棕黃色顆粒，多數(shù)呈彌漫性分布于細胞漿內(nèi)，少數(shù)定位于胞核，見圖1。對照組、肝硬化組和肝癌組gp96陽性表達率逐漸遞增，各組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

Mcl-1陽性表達物呈棕黃色顆粒，部分呈彌漫性分布于細胞漿內(nèi)，部分定位于胞核，見圖2。肝癌組和肝硬化組Mcl-1陽性表達率明顯高于對照組(P<0.05)，但肝癌組和肝硬化組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

肝癌組織與配對癌旁肝硬化組織、配對癌旁非肝硬化組織gp96、Mcl-1表達的比較見表2、表3。

注：(a)低分化肝癌組織中gp96的表達(×200)；(b)高分化肝癌組織中gp96的表達(×200)；(c)肝硬化組織中gp96的表達(×200)；(d)對照組gp96的表達(×100)

圖1肝癌組、肝硬化組和對照組gp96的表達

二、gp96、Mcl-1的表達與肝癌臨床病理學特征的關系

gp96的陽性表達與腫瘤有無包膜、TNM分期有關(P<0.05)，與患者的性別、年齡、腫瘤大小、血清甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)值、組織學分級、臨床分期、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染[即乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)陽性]及肝硬化與否無關(P>0.05)；Mcl-1陽性表達與腫瘤有無壞死和TNM分期有關(P<0.05)，與患者的性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤有無包膜、門靜脈有無癌栓、血清AFP值、組織學分級、腫瘤臨床分期、HBV感染以及肝硬化與否均無關(P>0.05)。見表4。

表1　肝癌組、肝硬化組和對照組gp96、Mcl-1陽性表達率　[例(%)]

注：與對照組比較，*P<0.05；與肝硬化組比較，#P<0.05

注：(a)低分化肝癌組織中Mcl-1的表達(×200)；(b)肝硬化組織中Mcl-1的表達(×200)；(c)對照肝組織中Mcl-1的表達(×100)

圖2　肝癌組、肝硬化組和對照組Mcl-1的表達

注：與肝癌組比較，*P<0.05

表3　肝癌與配對癌旁非肝硬化組織中gp96、Mcl-1

注：與肝癌組比較，*P<0.05

表4　gp96、Mcl-1表達與肝癌臨床病理學特征的關系

續(xù)表4

討論

肝硬化與肝癌的發(fā)生密切相關，兩者之間的關系長期以來一直受到重視，人們將肝硬化看作是肝癌的癌前病變。肝硬化尤其是乙型肝炎后肝硬化是肝癌發(fā)生最重要的一個危險因素[3]。

正常細胞中gp96的表達受細胞周期調(diào)控。但在腫瘤細胞中gp96呈持續(xù)的高誘導表達，而且是不需要應激的，突變的或不正常的蛋白質的存在刺激了gp96的合成。有學者認為gp96高表達可促進腫瘤的發(fā)生[7-8]。也有報道認為gp96的表達能增強機體對腫瘤的免疫反應[9]。由于其具有的分子伴侶功能，gp96與腫瘤抗原肽相結合，使其被抗原提呈細菌高效攝取，進而通過主要組織相容性復合體-I類分子限制性途徑激活細胞毒性T淋巴細胞，引發(fā)特異性抗腫瘤免疫應答。gp96自體腫瘤疫苗對于黑色素瘤和結腸癌的治療作用已經(jīng)進入了臨床Ⅰ/Ⅱ期評價[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)對照組、肝硬化組和肝癌組gp96陽性表達率逐漸遞增，且各組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。由此推測gp96可能參與了肝硬化的發(fā)生、發(fā)展及向肝癌的惡性轉化過程。此外，大分子HBV表面蛋白可以活化gp96的轉錄增強子，誘導gp96表達升高[12]。本研究中絕大部分肝硬化和肝癌患者的血清HBsAg為陽性，這有可能是造成gp96高表達的另一個原因。

本研究結果顯示gp96的陽性表達與腫瘤有無包膜、TNM分期有關(P<0.05)。腫瘤包膜可以阻止腫瘤細胞向外周擴散，對腫瘤患者的預后是一種積極的因素，而腫瘤TNM分期高是肝癌患者術后易復發(fā)和預后不良的重要因素[13]。由此可見，gp96的表達與肝癌的生物學行為有關，其過表達可能是造成肝癌擴散、浸潤和轉移的原因，是肝癌患者預后不良的重要因素。

目前對于小肝癌的診斷主要是依據(jù)AFP和影像學檢查。肝癌患者的血清AFP濃度與腫瘤大小大體上呈正相關。本研究顯示gp96的表達與腫瘤大小和血清AFP值無關。肝癌≤3 cm組和>3 cm組之間、AFP<400 μg /L組和AFP≥400 μg /L組之間gp96的陽性表達率差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，提示gp96對小肝癌也具有一定的診斷價值。

Mcl-1廣泛表達于人類多種正常組織中。最近的研究[14]證實Mcl-1的亞細胞定位與細胞的生長狀態(tài)密切相關：在成指數(shù)冪生長的細胞中，Mcl-1主要定位于線粒體；在處于靜止期的細胞中，Mcl-1主要定位于細胞核。Mcl-1可以被快速地誘導表達和降解。當細胞內(nèi)出現(xiàn)死亡信號，如紫外線照射、病毒感染時，Mcl-1可被迅速降解；而當生存信號和分化信號，如細胞因子和生長因子出現(xiàn)時則被迅速誘導表達。提示Mcl-1在細胞的生存和死亡調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。越來越多的研究表明Mcl-1在人類多種腫瘤組織中過表達，如非小細胞肺癌[15]、宮頸癌[16]等。FLEISCHER等[17]通過免疫組化和免疫印跡法發(fā)現(xiàn)，Mcl-1在肝癌組織中的表達顯著高于鄰近的癌旁組織，且其表達與腫瘤大小、腫瘤分級以及肝移植術前接受的治療無關。SEIGHART等[18]通過反義寡核苷酸技術干擾肝細胞癌細胞株Mcl-1的表達，發(fā)現(xiàn)肝細胞癌細胞的凋亡增加，且對化療藥物的治療反應增加。

本研究結果顯示，Mcl-1陽性顆粒主要位于細胞漿，少數(shù)見于胞核。本研究結果顯示肝癌組和肝硬化組Mcl-1陽性表達率明顯高于對照組(P<0.05)，但肝癌組和肝硬化組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Mcl-1的表達與肝癌患者的性別、年齡、腫瘤有無包膜、門靜脈有無癌栓、是否HBV感染以及血清AFP值無關，與腫瘤大小也無關。肝癌≤3 cm組和>3 cm組之間Mcl-1陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義。提示Mcl-1對小肝癌也具有一定的診斷價值。發(fā)生壞死的肝癌組織Mcl-1的表達強度高于無壞死的肝癌組織。腫瘤組織由于代謝旺盛，局部缺血、缺氧和酸性代謝產(chǎn)物的積聚，引起腫瘤細胞壞死，壞死局部炎癥反應強烈，產(chǎn)生大量的細胞因子，而細胞因子可以迅速誘導Mcl-1的表達升高[19]。同時，Mcl-1的高表達可以保護中性粒細胞免于凋亡，延長其壽命，進而參與炎癥反應[20]。

Mcl-1在肝癌組織中的表達高于對照肝組織，提示Mcl-1作為一種抗凋亡蛋白，通過保護肝癌細胞免受凋亡，增加肝癌細胞的生存力，使其得以不斷增生，在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。阻斷Mcl-1的表達或調(diào)節(jié)Mcl-1表達的信號通路可能有助于阻止肝癌的發(fā)生。

綜上所述，肝癌組、肝硬化組和對照組gp96、Mcl-1的表達存在差異，其過表達可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展有關。gp96可能參與了肝硬化的發(fā)生、發(fā)展及向肝癌的惡性轉化，有助于判斷肝癌患者的預后。

本研究的不足之處：首先由于作為正常對照的正常肝組織難以獲得，我們因而選擇了有可能存在癌前改變的癌旁非肝硬化組織替代。因此，對所得研究結果應謹慎對待。其次，本研究方法僅采用單一的半定量免疫組化量化分析，存在一定缺陷。后續(xù)我們將從基因水平逆轉錄聚合酶鏈反應及蛋白水平(免疫組化+免疫印跡法)，同時擴大樣本量進行深入研究，以期能增加結果的可信度。

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(本文編輯：龔曉霖)