徐　蓉,　葛　平,　陳　蓉,　劉學杰

(上海市臨床檢驗中心，上海 200126)

3種不同方法檢測艱難梭菌芽孢率的比較

徐蓉,葛平,陳蓉,劉學杰

(上海市臨床檢驗中心，上海 200126)

摘要：目的了解艱難梭菌檢測的芽孢率并進行比較。方法采用平板涂布法、相差顯微鏡計數法和孔雀綠染色法3種檢測方法對艱難梭菌ATCC 43596和VPI 10463經培養(yǎng)96 h和120 h 后的芽孢率進行了比較分析。結果顯示平板涂布法芽孢檢出率最高為(25.3%、15.6%)，變異較大(SD=7.1%，4.3%)；相差顯微鏡計數法和孔雀綠染色法結果相近分別為(13.3%、9.4%)、(13.4%、9.8%)，變異較小(SD=1.9%、0.8%)、(SD=1.4%、0.9%)。結論在選用平板涂布法檢測芽孢率時，建議聯(lián)合相差顯微鏡法或者孔雀綠染色法以減少偏移。

關鍵詞：芽孢；艱難梭菌；檢測

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)02-0201-03R446.5

文獻標志碼：碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.02.023

作者簡介：徐蓉，女，1973年生，本科，主要從事微生物檢驗工作。

收稿日期：(2014-12-25)

艱難梭菌(Clostridiumdifficile)為革蘭陽性厭氧芽孢桿菌，是醫(yī)院感染的主要病原菌之一，約25%～33%的抗菌藥物相關性腹瀉以及90%的偽膜性腸炎都是由艱難梭菌所致[1]。芽孢是艱難梭菌傳播的主要形式，具有感染性，耐熱、耐干燥，對許多消毒劑和抗菌藥物高度耐藥。因此，芽孢在宿主體外的有氧環(huán)境中可長期存在，體內則可能與艱難梭菌感染治療停藥后復發(fā)相關[2]。

文獻報道的艱難梭菌產芽孢率有較大差異，其原因可能與菌株之間的差異和樣本量的大小有關，亦可能與研究者們所用方法不同相關[3-5]。本實驗對平板涂布法、相差顯微鏡計數法和孔雀綠染色后計數法檢測艱難梭菌產芽孢率進行了比較分析。

材料和方法

一、材料

1. 實驗菌株采用國際標準菌株艱難梭菌ATCC 43596和VPI 10463。

2. 培養(yǎng)基和試劑Brucella瓊脂和厭氧發(fā)生袋為美國BBL Microbiology Systems公司產品；血紅素(5 mg/L)，維生素K1(5 mg/L)與牛磺膽酸鈉鹽為美國Sigma公司產品；脫纖維羊血為上海閔行區(qū)諸翟無菌動物血試劑供應站產品。0.01 M磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)為德國Merck公司產品。

二、方法

1. 厭氧菌培養(yǎng)冰凍菌株在布氏血平板上復蘇并傳代2次(37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h)，再次傳代，將平板上過夜培養(yǎng)的艱難梭菌用PBS制成麥氏0.5的菌懸液，取10 μL菌懸液分別涂布于布氏血平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)96 h和120 h。

2. 平板涂布法將平板上菌落全部刮入PBS懸液，將該菌懸液等量分裝成2管，一管直接用生理鹽水10倍系列稀釋，取0.1 mL菌液均勻涂布在添加?；悄懰猁}的布氏血平板，菌落計數(a：營養(yǎng)細胞和芽孢)；另一管65 ℃水浴20 min以殺死營養(yǎng)細胞，再用生理鹽水進行系列稀釋，取0.1 mL均勻涂布相同平板，厭氧培養(yǎng)48 h后菌落計數(b：芽孢)。產芽孢率=b/a×100%。

3. 相差顯微鏡計數法挑一個純菌落入4.5 mL PBS緩沖液混勻(或直接從菌液中取樣，必要時1∶10稀釋成合適濃度)，取7 μL加入Burker載玻片。置于相差顯微鏡下，菌液流動靜止后觀察。任取Burker載玻片上3個大區(qū)，共48個小區(qū)即48個視野進行計數。取10 μL加入產芽孢率 =芽孢數/(芽孢數+營養(yǎng)細胞數)×100%。

4. 孔雀綠染色后顯微鏡計數法將培養(yǎng)96 h的艱難梭菌作涂片、干燥、固定；然后滴加3～5滴孔雀綠染液于已固定的涂片上，并用木夾夾住載玻片在火焰上加熱，使染液冒蒸汽但勿沸騰或蒸干，加熱時間從染液冒蒸汽時開始計算約4~5 min；傾去染液，待玻片冷卻后水洗至孔雀綠不再褪色為止；用番紅水溶液復染1 min，水洗；待干燥后，置油鏡觀察，芽孢呈綠色，菌體呈紅色。觀察10個視野的營養(yǎng)細菌與芽孢數。產芽孢率 =芽孢數/(芽孢數+營養(yǎng)細胞數)×100%。

5. 重復性實驗2株標準菌株艱難梭菌ATCC 43596和VPI 10463分別在96 h和120 h培養(yǎng)后檢測芽孢率，同樣條件重復實驗3次。

三、統(tǒng)計學方法

采用Excel 2007計算百分比進行數據統(tǒng)計分析。

結果

一、3種不同方法檢測艱難梭菌芽孢率結果比較

ATCC 43596、VIP 10463培養(yǎng)96 h，用平板涂布法檢測芽孢率最高(平均檢出率為25.3%、15.6%)，培養(yǎng)120 h(平均檢出率為43.0%、35.4%)，但變異較大；相差顯微鏡計數法(平均檢出率為13.3%、9.4%)，培養(yǎng)120 h(平均檢出率為35.0%、27.8%)和孔雀綠染色法(平均檢出率為13.4%、9.8%)，培養(yǎng)120 h(平均檢出率為32.7%、28.2%)結果相近且變異較小，結果見表1。

表1　3種不同方法對培養(yǎng)96 h、120 h艱難梭菌芽孢檢測率的比較　(%)

討論

平板涂布法是最為常用的檢測芽孢率的方法。該方法原理為在65 ℃水浴20 min或100%乙醇共同孵育后，營養(yǎng)細胞被殺死，僅芽孢能存活。經過上述處理后在平板上生長的克隆數量就可代表芽孢數量。但是，雖然經過水浴或者乙醇處理，仍有可能少部分對熱/化學抗性強的營養(yǎng)細胞遺留下來，也可能有少許芽孢并沒有轉化為營養(yǎng)細胞。因此，在研究不同菌株芽孢率的時候需考慮細菌生長情況，芽孢抗性以及芽孢的萌發(fā)能力。因此，用平板計數法時建議使用營養(yǎng)條件好的培養(yǎng)基，在艱難梭菌芽孢率檢測時可在培養(yǎng)基中加用含有促芽孢萌發(fā)的牛磺膽酸鹽[6]。

芽孢與營養(yǎng)細胞相比化學組成存在較大差異，容易在相差顯微鏡下觀察，但對技術人員的經驗要求非常高。因為觀察的是在PBS懸液中的活細胞，所以首先必須速度快，否則液體干掉后就不能再進行觀察；其次因為是活細胞，在液體中會以不同面顯示，粗看可能是營養(yǎng)細胞，但翻個面其實有芽孢，因此，技術人員的經驗非常重要。

孔雀綠染色法也是觀察芽孢常用的方法。其原理為芽孢壁厚、透性低，著色、脫色均較困難。因此，用著色力強的染色劑(如孔雀石綠)在加熱條件下進行染色時，染料不僅可以進入菌體，而且也可以進入芽孢，進入菌體的染料可經水洗脫色，而進入芽孢的染色的染料則難以透出，若再用復染液(如沙黃水溶液)染色后，芽孢仍然保留初染劑的顏色，而菌體被染成復染劑的顏色，即菌體和芽孢分別染成紅色和綠色易于區(qū)分。但缺點也很明顯，芽孢壁厚染色困難，所以有時會有染色失敗[7]。而且孔雀綠染色只能檢測芽孢率，不能計數營養(yǎng)細胞或芽孢的數量。

3種檢測艱難梭菌芽胞方法都有明顯的優(yōu)缺點。其中平板涂布法結果變異較大，相差顯微鏡法和孔雀綠染色法結果差異相對較小且較為接近。因此，建議在做艱難梭菌的芽孢率研究時至少同時采用2種方法以減少結果的偏移。今后應考慮研發(fā)新的檢測方法或者對現有方法進行改進，使得結果更為穩(wěn)定可靠、且簡便易操作。

參考文獻

[1]FREEMAN J, BAUER MP, BAINES SD, et al. The changing epidemiology of Clostridium difficile infections[J]. Clin Microbiol Rev,2010,23:529-549.

[2]孫靜,陳建華.枯草芽孢桿菌形成芽孢時母細胞中基因表達的調控[J].生物技術，2007，17:79-83.

[3]MERRIGAN M, VENUGOPA A, MALLOZZI M, et al. Human Hypervirulent Clostridium difficile Strains Exhibit Increased Sporulation as Well as Robust Toxin Production[J]. J Bacteriol, 2010,192:4904-4911.

[4]VOHRA P, POXTON I. Comparison of toxin and spore production in clinically relevant strains of Clostridium difficile[J]. Microbiology, 2011,157：1343-1353.

[5]BURNS DA, HEAP JT, MINTON NP. The diverse sporulation characteristics of Clostridium difficile clinical isolates are not associated with type[J]. Anaerobe,2010,16:618-622.

[6]SORG JA, SONENSHEIN AL. Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid[J]. J Bacteriol, 2010,192：4983-4990.

[7]宋淑賢，聶清.微生物學常用細菌染色方法的改進[J].黑龍江醫(yī)藥科學，2001，24：36.

(本文編輯：儲怡星)