彭友帆，　劉　洋，　張朝霞

(新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830054)

熒光原位雜交技術(shù)可早期有效的預(yù)測(cè)慢性粒細(xì)胞性白血病的預(yù)后

彭友帆，劉洋，張朝霞

(新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830054)

摘要：目的本研究探討熒光原位雜交技術(shù)(FISH)在甲磺酸伊馬替尼(IM)治療慢性粒細(xì)胞性白血病(CML)長(zhǎng)期預(yù)后中的早期預(yù)測(cè)價(jià)值。方法選取60例IM治療階段的CML患者骨髓標(biāo)本，運(yùn)用骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)(BM)、FISH、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)以及常規(guī)染色體分析方法(CC)對(duì)入組的CML患者每3~6個(gè)月進(jìn)行48個(gè)月療效觀察。結(jié)果運(yùn)用FISH技術(shù)在第3個(gè)月、第6個(gè)月以及第12個(gè)月檢測(cè)融合基因Bcr-abl陽(yáng)性細(xì)胞<10%的病例，其在第12個(gè)月具有較高的細(xì)胞遺傳學(xué)完全緩解(CCR)，同時(shí)，在第36個(gè)月和第48個(gè)月所觀察的大多數(shù)患者均獲得了無事件生存，與Bcr-abl陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)>10%的患者組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相似的，運(yùn)用RT-PCR和CC在第3個(gè)月和第6個(gè)月檢測(cè)Bcr-Abl mRNA以及陽(yáng)性分裂相百分?jǐn)?shù)，兩組病例在第36個(gè)月和第48個(gè)月的無事件生存率(EFS)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，僅在第12個(gè)月差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論FISH分析技術(shù)可以為CML的長(zhǎng)期預(yù)后提供早期有效的預(yù)測(cè)。

關(guān)鍵詞：慢性粒細(xì)胞性白血??；熒光原位雜交技術(shù)；無事件生存率；早期預(yù)測(cè)價(jià)值

中圖分類號(hào)：

文章編號(hào)：1673-8640(2015)02-0167-06Q503

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.02.016

Abstract:ObjectiveTo investigate the early predictive significance of fluorescence in-situ hybridization (FISH) in the long-term prognosis of treating chronic myeloid leukemia(CML) by imatinib(IM). MethodsA total of 60 patients with CML undergoing IM treatment were enrolled, their bone marrow specimens were collected, and they were observed per 3-6 months for 48 months for treatment efficiency by bone marrow cell morphology(BM), FISH, reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and karyotyping(CC). ResultsApplying FISH to detect the patients showed that BCR-ABL positive cell <10% in the 3rd month, the 6th month and the 12th month, which there was high CCR in the 12th month, and the most patients got free-event survival in the 36th and 48th months. Comparing with those whose BCR-ABL positive cell >10%, there was statistical significance (P<0.05). Similarly, applying RT-PCR and CC to detect Bcr-Abl mRNA and positive mitosis phase, there was no statistical difference in the 36th and 48th months(P>0.05), and there was statistical significance only in the 12th month (P<0.05). ConclusionsFISH is able to provide the early and effective prediction for the long-term prognosis of CML.

作者簡(jiǎn)介：彭友帆，男，1988年生，碩士，主要從事血液病實(shí)驗(yàn)室診斷工作。

收稿日期：(2014-04-15)

Fluorescence in-situ hybridization can provide the early and effective prediction for the prognosis of chronic myeloid leukemiaPENGYoufan,LIUYang,ZHANGZhaoxia.(XinjiangMedicalUniversity,XinjiangUrumqi830054,China)

Key words: Chronic myeloid leukemia; Fluorescence in-situ hybridization; Free-event survival rate; Early predictive significance

慢性粒細(xì)胞性白血病(chronic myeloid leu-kemia,CML)為一種源于骨髓干細(xì)胞的惡性增殖性疾病，是臨床上較為多見的白血病類型之一，可以發(fā)生于任何年齡的人群，以中老年人群最常見[1]。其發(fā)病機(jī)制由于t(9;22)(q34;q11)易位而形成的費(fèi)城染色體和相應(yīng)的Bcr-Abl融合基因，進(jìn)一步生成具有異常活性的絡(luò)氨酸激酶被普遍認(rèn)為是CML發(fā)生、發(fā)展的原因[2]。因此，在治療方面，據(jù)研究報(bào)道表明，對(duì)于甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate, IM)在慢性期CML患者的治療上，雖然運(yùn)用IM對(duì)于慢性期治療的臨床緩解率(clinical remission rate,CR)可達(dá)75%~90%，但少部分患者IM治療效果不佳[3]，且據(jù)臨床觀察，有部分患者由于經(jīng)濟(jì)問題中斷IM的治療，使CR和無事件生存率(event free survival,EFS)降低。顯然，對(duì)于IM治療沒有良好反應(yīng)和長(zhǎng)期IM治療中預(yù)后較差的CML患者需要運(yùn)用適當(dāng)?shù)募夹g(shù)手段對(duì)其治療效果和預(yù)后進(jìn)行早期的預(yù)測(cè)，以便臨床早期采取干預(yù)措施提高患者的長(zhǎng)期生存率和生活質(zhì)量。

材料和方法

一、研究對(duì)象

本研究收集了新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2007年至2013年60例經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、組織化學(xué)、細(xì)胞及分子遺傳學(xué)確診的初診CML并接受IM作為一線治療患者的臨床資料，男40例，女20例，年齡21~87歲，中位年齡54歲。本研究經(jīng)過新疆醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，并且獲得每位參與者的知情同意。

二、治療方法

入組患者第一次使用IM治療且后續(xù)長(zhǎng)期口服，治療劑量根據(jù)患者的臨床療效和不良反應(yīng)進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)整。其中8例在IM治療前使用2~6周的羥基脲(hydroxyurea,HU)治療。

三、療效監(jiān)測(cè)

人組患者治療期間每3~6個(gè)月例行一次骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)(bone marrow cell morphology ，BM)、常規(guī)染色體分析(karyotyping，CC)、熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization, FISH)以及逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time pcr，RT-PCR)進(jìn)行病情監(jiān)測(cè)。

四、療效標(biāo)準(zhǔn)

參考張之南《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[4]。血液學(xué)完全緩解(complete hematologic response, CHR)標(biāo)準(zhǔn)：外周血白細(xì)胞<10×109/L，中性粒細(xì)胞≥1.5×109/L，白細(xì)胞分類正常，血小板(100~350)×109/L，骨髓中原始粒細(xì)胞+早幼粒細(xì)胞比例<5%，無髓外浸潤(rùn)。細(xì)胞遺傳學(xué)完全緩解(complete cytogenetic response, CCR)：細(xì)胞分裂中期可檢測(cè)到的Ph染色體陽(yáng)性細(xì)胞消失。分子生物學(xué)效應(yīng)：(1) “完全”分子學(xué)緩解(complete molecular response, CMR)：定量PCR未測(cè)出Bcr-AblmRNA；(2)主要分子學(xué)緩解(major molecular response, MMR)：定量PCR≤0.10(或較治療前下降≥3 log)。

五、試劑和儀器

1.CC骨髓細(xì)胞培養(yǎng)基(青島萊福),染色體增長(zhǎng)劑，秋水仙堿，0.075 mol/L KCL低滲溶液，NAPCO孵育箱。

2.FISHBcr-Abl序列探針(英國(guó)cytocell), SCC液，吐溫20液,4，6-二-2苯吲哚(DAPI)抗熒光衰減劑。加熱平板，雜交儀(英國(guó)THERRMO)，熒光顯微鏡(LEICA公司DM-6000)。

3 .RT-PCRBcr-Abl熒光定量試劑(北京思爾成), 淋巴細(xì)胞分離液，生理鹽水，RPMI1640, RBC裂解液, Trizol ，氯仿，異丙醇，70%乙醇溶液，焦碳酸二乙酯(DEPC)水，RT-PCR( ABI PRISM系列)。

六、檢測(cè)方法

1.CC檢測(cè)分析采用直接培養(yǎng)法和短期培養(yǎng)法制備骨髓細(xì)胞染色體，R帶顯帶技術(shù)分析細(xì)胞染色體核型，異常核型按國(guó)際細(xì)胞遺傳學(xué)命名體制(ISCN，1995)進(jìn)行核型分析。油鏡下選擇帶紋清晰、分布適中的中期分裂細(xì)胞，每例標(biāo)本分析中期細(xì)胞至少20 個(gè)中期分裂相,見圖1和圖2，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞分裂相占總細(xì)胞分裂相的百分?jǐn)?shù)。

2.FISH檢測(cè)分析將收獲的細(xì)胞滴片、室溫洗滌、脫水，雜交儀變性，雜交后標(biāo)本置于72 ℃ 0.4×SCC(pH值7.0)中洗滌2 min，經(jīng) 2×SCC中沖洗后，放入0.05%的吐溫20液30 s后,沖洗標(biāo)本，復(fù)染，封片，應(yīng)用熒光顯微鏡在DAPI/異硫氰酸熒光素(FITC)/TexasRed三色濾色鏡激發(fā)下, 計(jì)數(shù)邊界清晰、無重疊 、結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞核，使用染色體自動(dòng)分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集和分析，每例標(biāo)本至少分析500個(gè)間期細(xì)胞核，見圖3。

3.RT-PCR檢測(cè)方法(1)骨髓單個(gè)核細(xì)胞(marrow mononuclear cells，MNC)分離以及細(xì)胞總RNA的提取：使用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，細(xì)胞總RNA的提取嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作；(2)Bcr-Abl基因檢測(cè)：取RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA備用，標(biāo)準(zhǔn)品10倍稀釋，測(cè)控管與參控管的應(yīng)體系為cDNA模板或定量標(biāo)準(zhǔn)品5 μL、 反應(yīng)混合液44.0 μL、Taq聚合酶1.0 μL，反應(yīng)終體積為50 μL，各反應(yīng)管置RT-PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增,循環(huán)參數(shù)為93 ℃預(yù)變性2 min,93 ℃ 30 s， 55 ℃ 60 s共40個(gè)循環(huán)，最后于33 ℃保溫反應(yīng)過程中實(shí)時(shí)檢測(cè)擴(kuò)增過程，根據(jù)激發(fā)熒光強(qiáng)度變化計(jì)算機(jī)作出定量結(jié)果及定量曲線，最終獲得的Bcr-Abl基因的拷貝數(shù)，計(jì)Bcr-Abl基因的拷貝數(shù)計(jì)為百分?jǐn)?shù)。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，生存資料采用Kaplan-Meier統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、CML經(jīng)IM治療期間的血液學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)緩解率

所有入組患者分別在第3個(gè)月、第6個(gè)月、第9個(gè)月、第12個(gè)月、第24個(gè)月、第36個(gè)月以及第48個(gè)月的血液學(xué)完全緩解(CHR)、細(xì)胞遺傳學(xué)完全緩解(CCR)和主要分子學(xué)緩解(MMR)結(jié)果見表1。

表1　血液學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)緩解率緩解率　[例(%)]

圖1　常規(guī)染色體分析模式圖

圖2　常規(guī)染色圖分析t(9;22)異位

圖3　BCR/ABL雙色雙融合探針見雙融合細(xì)胞

二、CML患者生存分析結(jié)果

臨床隨訪過程中，在36個(gè)月持續(xù)治療期間，3例發(fā)生毒副反應(yīng)，1例進(jìn)行了骨髓移植手術(shù)。7例出現(xiàn)CML加速期，其中5例第二次絡(luò)氨酸激酶關(guān)鍵性阻斷藥物治療后重新獲得緩解，另2例加速期患者死亡。1例在第17個(gè)月出現(xiàn)急變，后續(xù)行骨髓移植后死亡。無事件生存率(event free survival,EFS)曲線見圖4。

圖4　CML患者IM治療48個(gè)月期間無事件

三、3種檢測(cè)方法針對(duì)12個(gè)月的CCR監(jiān)測(cè)以及CML患者長(zhǎng)期預(yù)后分析結(jié)果。見表2。

運(yùn)用FISH在第3和第6個(gè)月以及第12個(gè)月檢測(cè)融合基因Bcr-abl陽(yáng)性細(xì)胞， FISH檢測(cè)Bcr-abl陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)<10%的病例組在第12個(gè)月具有較高的CCR，并且，在第36個(gè)月以及第48個(gè)月的EFS明顯高于Bcr-abl陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)>10%的病例組，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，相似的，運(yùn)用RT-PCR和CC在第3個(gè)月和第6個(gè)月檢測(cè)其Bcr-Abl融合基因和費(fèi)城染色體，兩病例組在第36個(gè)月以及第48個(gè)月的EFS差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，RT-PCR和CC在第12個(gè)月檢測(cè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2　CC、FISH以及RT-PCR對(duì)于CCR和長(zhǎng)期預(yù)后預(yù)測(cè)分析結(jié)果

討論

IM作為治療CML的一線藥物，據(jù)國(guó)外研究報(bào)道，在第3個(gè)月出現(xiàn)首次CCR的患者，5年生存率的人數(shù)比例達(dá)95%[5]?？梢奀CR可以作為IM治療CML后期預(yù)后評(píng)價(jià)一個(gè)可靠的指標(biāo)，CML患者獲得持續(xù)的CCR對(duì)于提高患者長(zhǎng)期生存率具有重要的意義，TAKAHASHI等[6]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ISH可以有效的對(duì)IM治療期間的CCR進(jìn)行判斷，對(duì)于長(zhǎng)期服用IM的CML患者，在第3個(gè)月應(yīng)用FISH技術(shù)對(duì)Bcr-abl融合基因進(jìn)行檢測(cè)，有利于監(jiān)控IM的療效。據(jù)TAKAKASHI等[7]研究表明，F(xiàn)ISH對(duì)IM治療CML初期階段的臨床預(yù)后具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。但在上述研究中，F(xiàn)ISH對(duì)于CML患者長(zhǎng)期預(yù)后的早期判斷并沒有得到進(jìn)一步的闡述和研究，本研究運(yùn)用CC、FISH以及RT-PCR對(duì)60例經(jīng)IM治療的CML患者長(zhǎng)達(dá)48個(gè)月的跟蹤監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用FISH技術(shù)在第3個(gè)月和第6個(gè)月檢測(cè)Bcr-abl陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)<10%的病例，其在第12個(gè)月具有較高的CCR，同時(shí)，所觀察的患者在第36個(gè)月和第48個(gè)月大多數(shù)獲得了無事件生存，具有良好的預(yù)后，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步觀察可發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ISH在第12個(gè)月檢測(cè)結(jié)果也能對(duì)第36個(gè)月和第48個(gè)月的無事件生存率提供預(yù)測(cè)，與OHM等[8]研究結(jié)果相符合。觀察RT-PCR和CC的檢查結(jié)果，其不能在第3個(gè)月和第6個(gè)月為36個(gè)月以后的預(yù)后情況提供早期預(yù)測(cè)，僅在第12個(gè)月可發(fā)現(xiàn)RT-PCR和CC在第36個(gè)月和第48個(gè)月的預(yù)測(cè)價(jià)值，并不能與FISH相似地在CML治療期間的早期做出預(yù)后判斷。

臨床對(duì)于CML診斷和療效評(píng)價(jià)的應(yīng)用上，以往CC作為臨床診斷CML的“金標(biāo)準(zhǔn)”，甚至作為絡(luò)氨酸激酶阻斷藥物治療CML的療效判斷和CML預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)之一[9]，但由于CC只能分析骨髓標(biāo)本，每例骨髓細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)本不可能均可獲得滿意的細(xì)胞分裂相[10]，且CC一般分析20～50個(gè)細(xì)胞分裂相的變化,因而對(duì)染色體異位篩查存在一定的漏檢率。再者，F(xiàn)ISH分析外周血細(xì)胞能和骨髓細(xì)胞能達(dá)到一樣的效果，不但能分析非分裂相細(xì)胞的Bcr-Abl融合基因的表達(dá)，而且FISH一次性能觀察大量的細(xì)胞，并且運(yùn)用特異性熒光探針對(duì)異?；蛭稽c(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記并雜交，進(jìn)而具有高度的敏感性[11]，同時(shí)，據(jù)王小青等[12]研究報(bào)道，F(xiàn)ISH技術(shù)對(duì)CML的診斷與CC相比，具有快速、可靠、成功率高的特點(diǎn)，可用于病情監(jiān)測(cè)。顯然，F(xiàn)ISH對(duì)于CML患者預(yù)后判斷具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

在目前，由于RT-PCR具有高度敏感性，其對(duì)于CML患者預(yù)后判斷和IM的療效觀察明顯優(yōu)于CC[13]，且能監(jiān)測(cè)CML患者IM期間的療效反應(yīng)或移植術(shù)后的微小殘留量病變[14-15]，因此，RT-PCR技術(shù)在CML的監(jiān)測(cè)上得到了廣泛的運(yùn)用，據(jù)HANFSTEIN和HUGHES等[5,16]研究表明，在第3個(gè)月檢測(cè)BCR-ABL的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，Bcr-Abl mRNA比例<10%的群體與比例>10%的群體相比具有較高的EFS，在長(zhǎng)期IM治療期間獲得了良好的預(yù)后，但在第6個(gè)月和第12個(gè)月檢測(cè)BCR-ABL的mRNA轉(zhuǎn)錄水平并不能為CML患者的EFS和長(zhǎng)期預(yù)后提供有效的判斷，可見RT-PCR僅在第3個(gè)月可以為CML的預(yù)后提供早期預(yù)測(cè)。最近，據(jù)KLAMOVA等[17]針對(duì)458例IM治療期間的CML患者長(zhǎng)達(dá)5年隨訪研究表明，在第6個(gè)月和第12個(gè)月檢測(cè)BCR-ABL的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，比例小于10%的群體獲得了良好的EFS，即RT-PCR在第6個(gè)月和第12個(gè)月能為CML的預(yù)后提供預(yù)測(cè)。但本次研究?jī)H發(fā)現(xiàn)RT-PCR在第12個(gè)月的預(yù)測(cè)價(jià)值，與KLAMOVA等[17]的研究結(jié)果相符，顯然，在不同地區(qū)的不同實(shí)驗(yàn)室，對(duì)于Bcr-abl的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)結(jié)果有所差異，其原因由于目前RT-PCR對(duì)于Bcr-abl融合基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)，在不同的實(shí)驗(yàn)室從標(biāo)本的采集到室內(nèi)質(zhì)量控制以及定量報(bào)告的結(jié)果存在較大的差異，從而減低了不同實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的可比性，更重要的是缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，主要包括內(nèi)部控制基因和外部參考基因的標(biāo)準(zhǔn)化。尤其在美國(guó)，由于很多分子學(xué)實(shí)驗(yàn)室并沒有根據(jù)IS標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)試驗(yàn)的影響因素，從而很難通過單個(gè)Bcr-abl的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的測(cè)定評(píng)價(jià)CML患者的療效和預(yù)后，因此，不同地區(qū)的不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)于Bcr-abl融合基因檢測(cè)的結(jié)果存在一定的差異，有待通過標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)則進(jìn)一步提高[18]， BRANFORD等[19]研究也證實(shí)了這點(diǎn)，即RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果是不穩(wěn)定的，在不同的實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果有一定的差異。為此，國(guó)內(nèi)首個(gè)白血病領(lǐng)域分子檢測(cè)室間比對(duì)項(xiàng)目“中國(guó)CML患者PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目”啟動(dòng)，通過比對(duì)獲得有效的轉(zhuǎn)換系數(shù)(CF)，相信在以后Bcr-ablmRNA的檢測(cè)將有一個(gè)統(tǒng)一的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)[20]。另外，本次研究屬于小標(biāo)本，且部分患者來至偏遠(yuǎn)的南疆地區(qū)，由于條件限制而缺乏一定的依從性，可能對(duì)研究結(jié)果也存在一定的影響，有待提高標(biāo)本量進(jìn)一步探討和研究。但本研究檢測(cè)Bcr-abl融合基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室為ISO15189認(rèn)證實(shí)驗(yàn)室，并且使用ABL參考基因，從而一定程度上減少了單個(gè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異。

在臨床上，對(duì)于初診為CML患者，往往使用絡(luò)氨酸激酶阻斷藥物治療作為CML治療的一線藥物，而有些患者在長(zhǎng)期治療過程中，可能由于耐藥等原因沒獲得良好的預(yù)后。因此，需要一種早期的監(jiān)測(cè)手段預(yù)測(cè)IM治療過程中的預(yù)后，以便臨床早期實(shí)施干預(yù)措施，盡管RT-PCR在CML療效的監(jiān)測(cè)方面得到了廣泛的運(yùn)用，且在國(guó)內(nèi)已經(jīng)開展的比較成熟，其在CML的診斷和臨床療效監(jiān)測(cè)上已經(jīng)作為了一種常規(guī)檢查，但本次研究表明，F(xiàn)ISH分析技術(shù)可以為CML的預(yù)后提供早期有效的預(yù)測(cè)。

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(本文編輯：范基農(nóng))