李靜，龔成，曾鋒( 麻城市人民醫(yī)院，湖北麻城438300;湖北省中南醫(yī)院)

單核細(xì)胞趨化蛋白-1對(duì)人卵巢癌CaOV3細(xì)胞黏附、侵襲能力的影響及其機(jī)制

李靜1，龔成2，曾鋒1
( 1麻城市人民醫(yī)院，湖北麻城438300;2湖北省中南醫(yī)院)

摘要:目的探討單核細(xì)胞趨化蛋白-1( MCP-1)對(duì)人卵巢癌CaOV3細(xì)胞黏附、侵襲能力的影響及其機(jī)制。方法將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人卵巢癌CaOV3細(xì)胞隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組，觀察組經(jīng)MCP-1( 20 μg/mL)預(yù)處理，對(duì)照組不予處理。兩組行體外黏附試驗(yàn)，記錄黏附Fibronectin、Collagen及Laminin蛋白的細(xì)胞數(shù);行體內(nèi)黏附試驗(yàn)，記錄黏附的細(xì)胞球體數(shù)目、體積及部位;行細(xì)胞侵襲試驗(yàn)，記錄穿膜細(xì)胞數(shù)。采用Western blotting法檢測(cè)兩組上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化指標(biāo)(上皮指標(biāo)E-cadherin，間質(zhì)指標(biāo)Vimentin、N-cadherin)的表達(dá)。結(jié)果觀察組黏附Fibronectin、Collagen 及Laminin蛋白的細(xì)胞數(shù)及穿膜細(xì)胞數(shù)均高于對(duì)照組，P均＜0.01。兩組腫瘤細(xì)胞以細(xì)胞球體形式黏附在小鼠大網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞部位，并且觀察組黏附的細(xì)胞球體數(shù)目更多、球體更大。觀察組E-cadherin低于對(duì)照組，Vimentin、N-cadherin均高于對(duì)照組，P均＜0.01。結(jié)論MCP-1可提高人卵巢癌CaOV3細(xì)胞的黏附、侵襲能力，可能與其促進(jìn)上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。

關(guān)鍵詞:卵巢癌;單核細(xì)胞趨化蛋白-1;黏附;侵襲;上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化

卵巢癌不同于其他實(shí)體瘤，其侵襲轉(zhuǎn)移方式主要局限在腹腔內(nèi)部而很少發(fā)生血液轉(zhuǎn)移［1～4］。腹腔黏附是腹腔播散的第一步，單個(gè)腫瘤細(xì)胞或腫瘤球體黏附在體腔器官的系膜細(xì)胞表面，進(jìn)一步種植發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，從而形成轉(zhuǎn)移灶［5］。單核細(xì)胞趨化蛋白-1( MCP-1)主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等釋放，對(duì)單核細(xì)胞具有趨化活性，并可以激活單核細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞［6］。研究表明，卵巢癌患者癌組織及腹水中MCP-1水平升高，且MCP-1高表達(dá)的卵巢癌患者生存期低于低表達(dá)者［7～9］。目前，MCP-1表達(dá)升高是否與卵巢癌的腹腔播散有關(guān)尚不明確。2013年11月～2014年6月，我們觀察了MCP-1對(duì)人卵巢癌CaOV3細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力及上皮細(xì)胞間質(zhì)化的影響，以期為了解卵巢癌腹腔播散機(jī)制并遏制其播散提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料人卵巢癌CaOV3細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心( ATCC)。BALB/c-nu小鼠6只，體質(zhì)量16～20 g，購(gòu)于北京華阜康公司。McCoy's 5A培養(yǎng)基及FBS購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，MCP-1蛋白及ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于美國(guó)R＆D公司，E-cadher in、N-cadherin、Vimentine及GAPDH兔單抗均購(gòu)自美國(guó)Epitomics公司，細(xì)胞染料PKH-67購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Corning公司Matrigel購(gòu)于美國(guó)BD公司，免疫組化試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組將CaOV3細(xì)胞置于含10% FBS的McCoy's 5A培養(yǎng)液(含青霉素100 U/mL及鏈霉素100 μg/mL)中，于37℃、5% CO2條件下傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組。

1.3 MCP-1對(duì)CaOV3細(xì)胞黏附能力影響的觀察

1.3.1體外黏附試驗(yàn)觀察組經(jīng)MCP-1( 20 μg/mL)預(yù)處理12 h，對(duì)照組不予處理。將兩組細(xì)胞按1×104/孔接種于備用的96孔板，每孔設(shè)6個(gè)復(fù)孔。包被Fibronectin 10 μg/mL、Collagen I 10 μg/mL、Laminin 5 μg/mL于4℃過(guò)夜，PBS洗凈后，用1%牛血清白蛋白于37℃條件下封閉1 h。30 min后吸棄上清，PBS吹打掉未黏附細(xì)胞，100倍光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算黏附細(xì)胞數(shù)，取其平均值。

1.3.2體內(nèi)黏附試驗(yàn)將CaOV3細(xì)胞用PKH-67染料染色，觀察組經(jīng)MCP-1( 20 μg/mL)預(yù)處理12 h，對(duì)照組不予處理。取1×106個(gè)細(xì)胞重懸在100 μL PBS中，分別注入小鼠(每組3只)腹腔。4 h后處死小鼠，洗凈腹腔未黏附細(xì)胞。在熒光顯微鏡下觀察兩組胃大彎下部大網(wǎng)膜組織，于40倍光鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野，觀察大網(wǎng)膜處黏附的腫瘤細(xì)胞球體數(shù)量和體積。

1.4 MCP-1對(duì)CaOV3細(xì)胞侵襲能力影響的觀察兩組行細(xì)胞侵襲試驗(yàn)。Transwell上室每孔加入50 μL的Matrigel( McCoy's 5A培養(yǎng)液按1∶5稀釋)，37℃放置1 h。觀察組經(jīng)MCP-1( 20 μg/mL)預(yù)處理12 h，對(duì)照組不予處理。凝固后上室加入1×104的兩組細(xì)胞(均經(jīng)100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基重懸)，下室加入600 μL含30% FBS的McCoy's 5A培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h。取出小室，用棉簽拭去膜上層細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次，結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗凈后風(fēng)干。高倍鏡下選取5個(gè)不同視野，計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.5 MCP-1對(duì)CaOV3細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化指標(biāo)表達(dá)影響的觀察采用Western blotting法。觀察組經(jīng)MCP-1( 20 μg/mL)預(yù)處理24 h，對(duì)照組不予處理。胰酶消化后，PBS洗滌。RiPA蛋白裂解液提取收集細(xì)胞蛋白，每孔50 μg上樣量進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5% BSA封閉1 h，加入一抗( E-cadherin 1∶500，N-cadherin 1∶1 000，Vimentin 1∶1 000，GAPDH 1∶1 000)，4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜后，加入HRP標(biāo)記的二抗( 1∶3 000)，室溫孵育1 h。TBST充分洗掉背景后，增強(qiáng)ECL底物曝光。以GAPDH為內(nèi)參，采用Image J軟件計(jì)算條帶灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)量以目的蛋白和GAPDH的灰度比值表示。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組細(xì)胞黏附、侵襲能力比較體外黏附試驗(yàn)結(jié)果顯示，觀察組與對(duì)照組黏附Fibtonectin蛋白的細(xì)胞數(shù)分別為( 424±25)、( 216±13)個(gè)，黏附Colla gen蛋白的細(xì)胞數(shù)分別為( 261±16)、( 126±9)個(gè)黏附Laminin蛋白的細(xì)胞數(shù)分別為( 326±35)、( 176 ±23)個(gè);兩組比較，P均＜0.01。體內(nèi)黏附試驗(yàn)結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞以細(xì)胞球體形式黏附在小鼠大網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞部位，觀察組黏附的球體細(xì)胞數(shù)目為( 2.2±0.4)個(gè)，對(duì)照組為( 0.8±0.3)個(gè)，并且觀察組黏附的球體更大。觀察組穿膜細(xì)胞數(shù)為( 235± 12)個(gè)，對(duì)照組為( 126±8)個(gè);兩組比較，P＜0.01。

2.2兩組上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化指標(biāo)表達(dá)比較見(jiàn)表1。

表1　兩組上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化指標(biāo)表達(dá)比較(相對(duì)表達(dá)量，珔x±s)

3　討論

卵巢癌病死率居?jì)D科惡性腫瘤之首，確診時(shí)絕大多數(shù)處于疾病中晚期。廣泛的腹腔播散病灶和大量腹水是卵巢癌進(jìn)展期的主要臨床特征，以手術(shù)為主的綜合治療雖可延長(zhǎng)患者的生存期，但絕大多數(shù)卵巢癌患者術(shù)后兩年內(nèi)會(huì)復(fù)發(fā)。卵巢癌細(xì)胞腹腔黏附是腹腔侵襲轉(zhuǎn)移的第一步［11］，卵巢癌患者腹腔微環(huán)境中大量的免疫細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞、系膜細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞等相互作用，可能與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞抵抗失巢凋亡，并獲得更強(qiáng)的惡性潛能有關(guān)［12］。因此，腹腔播散病灶可能是卵巢癌患者預(yù)后不良的主要原因。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程指的是腫瘤細(xì)胞在疾病進(jìn)展過(guò)程中失去上皮標(biāo)志如E-cadherin，而獲得N-cad herin、Vimentin等間質(zhì)侵襲表型標(biāo)志。卵巢癌細(xì)胞失去E-cadherin表達(dá)后，細(xì)胞之間連接減弱，侵襲細(xì)胞外基質(zhì)能力增強(qiáng)，從而加速了卵巢癌的播散進(jìn)程研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者癌細(xì)胞E-cadherin低表達(dá)是預(yù)后不良的標(biāo)志［13］。因此，觀察卵巢癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化具有重要的意義。

研究發(fā)現(xiàn)，MCP-1可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移并可以促進(jìn)頭頸部腫瘤的進(jìn)展［14，15］。我們?cè)隗w內(nèi)外分別進(jìn)行了MCP-1對(duì)卵巢癌CaOV3細(xì)胞黏附能

力影響的觀察。體外黏附試驗(yàn)結(jié)果表明，MCP-1預(yù)處理后，CaOV3細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)Fibronectin、Collagen以及Laminin的黏附能力顯著增加。體內(nèi)黏附試驗(yàn)結(jié)果表明，MCP-1預(yù)處理后，小鼠大網(wǎng)膜處黏附的腫瘤細(xì)胞數(shù)量更多，球體更大。以上均表明，MCP-1可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞獲得更大的體內(nèi)外黏附能力，從而加速腹腔播散過(guò)程。同時(shí)，MCP-1預(yù)處理卵巢癌CaOV3細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)顯著增多，間質(zhì)指標(biāo)Vimentin、N-cadherin均顯著升高，上皮性指標(biāo)E-cadherin則顯著降低。這些結(jié)果表明卵巢癌微環(huán)境中的MCP-1能夠提高腫瘤細(xì)胞的黏附、侵襲能力，并可能與其促進(jìn)上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。但是關(guān)于MCP-1對(duì)卵巢癌細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

參考文獻(xiàn):

［1］Kenny HA，Chiang CY，White EA，et al.Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion ［J］.J Clin Invest，2014，124( 10) : 4614-4628.

［2］Latifi A，Luwor RB，Bilandzic M，et al.Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors［J］.PLoS One，2012，7( 10) : 46858.

［3］Pettee KM，Dvorak KM，Nestor-Kalinoski AL，et al.An mDia2/ROCK signaling axis regulates invasive egress from epithelial ovarian cancer spheroids［J］.PLoS One，2014，9( 2) : 90371.

［4］Kenny HA，Kaur S，Coussens LM，et al.The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin［J］.J Clin Invest，2008，118 ( 4) : 1367-1379.

［5］Vallen MJ，Schmidt S，Oosterhof A，et al.Primary ovarian carcinomas and abdominal metastasis contain 4，6-disulfated chondroitin sulfate rich regions，which provide adhesive properties to tumour cells［J］.PLoS One，2014，9( 11) : 111806.

［6］Ji WT，Chen HR，Lin CH，et al.Monocyte chemotactic protein 1 ( MCP-1) modulates pro-survival signaling to promote progression of head and neck squamous cell carcinoma［J］.PLoS One，2014 9( 2) : 88952.

［7］Ries CH，Cannarile MA，Hoves S，et al.Targeting tumor-associat ed macrophages with anti-CSF-1R antibody reveals a strategy fo cancer therapy［J］.Cancer Cell，2014，25( 6) : 846-859.

［8］Comito G，Giannoni E，Segura CP，et al.Cancer-associated fibro blasts and M2-polarized macrophages synergize during prostate car cinoma progression［J］.Oncogene，2014，33( 19) : 2423-2431.

［9］Su S，Liu Q，Chen J，et al.A positive feedback loop between mesenchymal-like cancer cells and macrophages is essential to breast cancer metastasis［J］.Cancer Cell，2014，25( 5) : 605-620.

［10］Gyorffy B，Lanczky A，Szallasi Z.Implementing an online tool fo genome-wide validation of survival-associated biomarkers in ovari an-cancer using microarray data from 1 287 patients［J］.Endoc Relat Cancer，2012，19( 2) : 197-208.

［11］Saika K，Sobue T.Cancer statistics in the world［J］.Gan To Ka gaku Ryoho，2013，40( 13) : 2475-2480.

［12］Carduner L，Leroy-Dudal J，Picot CR，et al.Ascites-induced shif along epithelial-mesenchymal spectrum in ovarian cancer cells: en hancement of their invasive behavior partly dependant on alphav in tegrins［J］.Clin Exp Metastasis，2014，31( 6) : 675-688.

［13］Strauss R，Li ZY，Liu Y，et al.Analysis of epithelial and mesen chymal markers in ovarian cancer reveals phenotypic heterogeneity and plasticity［J］.PLoS One，2011，6( 1) : e16186.

［14］Moisan F，F(xiàn)rancisco EB，Brozovic A，et al.Enhancement of pacli taxel and carboplatin therapies by CCL2 blockade in ovarian canc ers［J］.Mol Oncol，2014，8( 7) : 1231-1239.

［15］Kristjansdottir B，Partheen K，F(xiàn)ung ET，et al.Early inflammatory response in epithelial ovarian tumor cyst fluids［J］.Cancer Med 2014，3( 5) : 1302-1312.

收稿日期:( 2014-11-10)

通信作者:曾鋒，E-mail: 402892550@ qq.com

文章編號(hào):1002-266X( 2015) 32-0025-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R737.31

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.009