王正彪，武怡，張靜( 徐州醫(yī)學(xué)院，江蘇徐州000;徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

哮喘及呼吸道合胞病毒感染小鼠肺組織NGF、LIF表達(dá)及地塞米松對(duì)其的影響

王正彪1，武怡2，張靜1
( 1徐州醫(yī)學(xué)院，江蘇徐州221000;2徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

摘要:目的觀察支氣管哮喘及呼吸道合胞病毒( RSV)感染小鼠肺組織中神經(jīng)生長(zhǎng)因子( NGF)、白血病抑制因子( LIF)的表達(dá)，探討地塞米松對(duì)其表達(dá)的影響。方法將100只小鼠隨機(jī)分為5組各20只，哮喘組制作哮喘模型，感染組制作RSV感染模型，合并組和地米組均制作哮喘合并RSV感染模型，地米組于造模第21～25天腹腔注射地塞米松，對(duì)照組腹腔注射并霧化吸入等量生理鹽水。造模第26天處死小鼠，HE染色觀察肺組織病理變化，RT-PCR法及免疫組化法分別檢測(cè)肺組織NGF、LIF mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果哮喘組支氣管、毛細(xì)支氣管及伴行血管壁周圍有大量嗜酸性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管黏膜增厚，血管擴(kuò)張，血管平滑肌增生肥厚;感染組支氣管管腔狹窄甚至閉塞，肺泡上皮腫脹，肺泡間隔增寬，間質(zhì)性水腫;合并組兼具哮喘組、感染組的表現(xiàn);地米組無明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及間質(zhì)性改變;對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，基本無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。各組NGF、LIF mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，地米組、對(duì)照組均低于合并組、哮喘組、感染組，合并組高于哮喘組、感染組，P均＜0.01;地米組和對(duì)照組比較，P均＞0.05。結(jié)論RSV感染小鼠肺組織NGF及LIF表達(dá)增加，合并哮喘時(shí)增加更明顯，地塞米松干預(yù)對(duì)其肺組織NGF及LIF表達(dá)均有一定的抑制作用。

關(guān)鍵詞:呼吸道合胞病毒;神經(jīng)生長(zhǎng)因子;白血病抑制因子;哮喘;地塞米松

呼吸道合胞病毒( RSV)是嬰幼兒呼吸道感染常見的病原體之一，RSV感染可引起毛細(xì)支氣管炎并向哮喘轉(zhuǎn)化［1，2］。支氣管哮喘的基本病變?yōu)闅獾赖穆匝装Y，基本特征是氣道高反應(yīng)( AHR)。有研究證實(shí)，豚鼠感染RSV后氣道反應(yīng)性明顯增高［3，4］，但具體機(jī)制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，氣道的感覺神經(jīng)及其營(yíng)養(yǎng)因子與氣道炎癥的形成密切相關(guān)，其中神經(jīng)生長(zhǎng)因子( NGF)及白血病抑制因子( LIF)是參與及調(diào)控氣道神經(jīng)源性炎癥的重要炎癥因子［5，6］。地塞米松是長(zhǎng)效糖皮質(zhì)激素的一種，在哮喘的治療中應(yīng)用廣泛，其作用機(jī)制主要有抗炎、抑制Th2細(xì)胞的活化和EOS脫顆粒等，但其是否可調(diào)控NGF、LIF的表達(dá)鮮見報(bào)道。2013年10月～2015年11月，我們觀察了支氣管哮喘與RSV感染小鼠肺組織NGF、LIF表達(dá)變化，探討地塞米松對(duì)其表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1材料清潔級(jí)健康雌性Balb/c純系小鼠100只，6～8周齡，體質(zhì)量( 22±2) g，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。HyClone改良型RPMI 1640培養(yǎng)基及FBS均購(gòu)自賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司，制備成RSV病毒懸液( TCID5010－6.5/mL) ;雞卵白蛋白購(gòu)自美國(guó)Sigma公司; Al( OH)3干粉購(gòu)自上海生物工程有限公司; TRIzol總RNA提取試劑、TIANSscript cDNA第一鏈合成試劑盒及2× TaqRCR Master Mix購(gòu)自天根生物科技(北京)有限公司，NGF、LIF mRNA及GAPDH的引物由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)及合成; Rabbit Anti-NGF beta(免疫組化)購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司Rabbit Anti-LIF(免疫組化)購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，濃縮型DAB試劑盒及兔超敏二步法檢測(cè)試劑均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司HERAcell 150i細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司，DY-38型穩(wěn)流穩(wěn)壓定時(shí)電泳( PCR)儀購(gòu)自江蘇分化分析儀器廠，Olympus BX51顯微照相系統(tǒng)購(gòu)自日本奧林巴斯公司。

1.2造模與干預(yù)將100只小鼠隨機(jī)分為5組，各20只。哮喘組按文獻(xiàn)［7，8］制作哮喘模型，感染組按文獻(xiàn)［9，10］制作RSV感染模型，合并組及地米組參照上述兩組的方法制作哮喘合并RSV感染模型，地米組于造模第21～25天腹腔注射地塞米松0.2 mg/( kg·d) ;對(duì)照組于第1、14天腹腔注射生理鹽水0.2 mL，第21～25天給予37℃生理鹽水20 mL霧

化吸入30 min。

1.3肺組織病理學(xué)檢查飼養(yǎng)第26天，各組以10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，無菌條件下分離出兩側(cè)肺組織。4%甲醛固定液固定右肺中葉和左肺上葉肺組織，制作石蠟切片。行HE染色，400倍光鏡下觀察肺組織病理改變。

1.4肺組織NGF、LIF蛋白檢測(cè)采用免疫組化法。取石蠟切片，按免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行操作，陰性對(duì)照用PBS代替。細(xì)胞質(zhì)染成棕色為陽性細(xì)胞，用圖像分析軟件測(cè)定NGF、LIF陽性部位，以平均光密度( IOD)值表示其表達(dá)量。

1.5肺組織NGF、LIF mRNA相對(duì)表達(dá)檢測(cè)采用RT-PCR法。將右肺下葉制作組織勻漿，TRIzol液提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)其純度及完整性，按說明書逆轉(zhuǎn)錄mRNA為cDNA。NGF上游引物為5'-GTCAGTGTGTGGGTTGGAGA-3'，下游引物為5'-TTCTTGTAGCCTTCCTGCTG-3'，片段長(zhǎng)度304 bp; LIF上游引物為5'-TGCTTGCTGGGTGTATGAAC-3'，下游引物為5'-TTCTGTGGGAGCCTGAACA-3'，片段長(zhǎng)度356 bp; GAPDH上游引物為5'-CCTTCATTGACCTCAACTACA-3'，下游引物為5'-CTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'，片段長(zhǎng)度215 bp。反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性3 min，94℃變性45 s，58.8℃( NGF)/57℃( LIF)/60℃( GAPDH)退火45 s，72℃延伸2 min 共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠上電泳。凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)定目的基因與內(nèi)參基因灰度值的比值，以此表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，方差齊時(shí)多組間比較用單因素方差分析( One-way ANOVA)檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)多組間比較用Dunnett T3檢驗(yàn)，組間多重比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組肺組織病理學(xué)改變哮喘組支氣管、毛細(xì)支氣管及伴行血管壁周圍有大量嗜酸性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管黏膜增厚，血管擴(kuò)張，血管平滑肌增生肥厚;感染組支氣管管腔狹窄甚至閉塞，肺泡上皮腫脹，肺泡間隔增寬，間質(zhì)性水腫;合并組兼具哮喘組、感染組的表現(xiàn);地米組無明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及間質(zhì)性改變;對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰基本無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.2各組肺組織NGF、LIF mRNA及蛋白表達(dá)比較見表1。

表1　各組肺組織NGF、LIF mRNA及蛋白表達(dá)比較( n =20，珔x±s)

3　討論

氣道神經(jīng)源性炎癥學(xué)說認(rèn)為，氣管及支氣管上皮可因炎癥反應(yīng)受損脫落，導(dǎo)致感覺神經(jīng)末梢暴露并釋放活性物質(zhì);這些遞質(zhì)可反作用于外周靶細(xì)胞引起神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子升高［11］。NGF可由外周靶細(xì)胞合成，經(jīng)軸突攝取后逆行轉(zhuǎn)運(yùn)至背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和分化的作用，能增強(qiáng)神經(jīng)突觸的可塑性，從而刺激神經(jīng)遞質(zhì)分泌增加［12］; NGF還具有非神經(jīng)元細(xì)胞的生物活性，可參與和整合刺激自適系統(tǒng)的成熟及表達(dá)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，NGF 與LIF同屬神經(jīng)生長(zhǎng)因子家族成員，有相似的生物學(xué)活性［13］;二者均作為胞外刺激因子作用于效應(yīng)細(xì)胞過程中，具有相同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。當(dāng)一種因子受到抑制時(shí)，另一種因子的表達(dá)水平同樣受到抑制，故二者共同參與哮喘的發(fā)病，在RSV感染后導(dǎo)致支氣管哮喘發(fā)生過程中起協(xié)同作用［13］。

本研究顯示，HE染色后鏡下可見，感染組以炎性表現(xiàn)為主，無典型哮喘樣病理改變;但合并組病理組織改變較哮喘組、感染組明顯加重。據(jù)此推測(cè)RSV感染后并非直接導(dǎo)致支氣管哮喘發(fā)生，而是在一定程度上加重哮喘病理組織損傷。另外，與對(duì)照組比較，哮喘組、感染組和合并組NGF、LIF mRNA及蛋白表達(dá)均增加，僅與地米組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異提示哮喘氣道神經(jīng)源性炎癥的發(fā)生可能與多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子共同作用有關(guān)，這些因子的作用機(jī)制相似但并非相同［14～16］;地塞米松可同時(shí)抑制這些因子表達(dá)，引起其他相關(guān)致病因子的表達(dá)障礙，在臨床治療過程中，尋找抑制神經(jīng)生長(zhǎng)因子的抑制劑可減少

RSV感染后發(fā)生哮喘的概率。本研究為哮喘的防治提供了新思路。

參考文獻(xiàn):

［1］李小波，呼永河，亓占中，等.淺論高濕環(huán)境對(duì)哮喘發(fā)病的影響［J］.西南國(guó)防醫(yī)藥，2011，21( 1) : 76-78.

［2］Wu P，Hartert TV.Evidence for acausal relationship between respiratory syncytial virus infection and asthma［J］.Expert Rev Anti Infect Ther，2011，9( 9) : 731-745.

［3］方麗萍，戚好文，林漢軍，等.呼吸道合胞病毒感染導(dǎo)致豚鼠氣道反應(yīng)性增高及M2受體作用的研究［J］.中國(guó)病理生理雜志，2008，24( 3) : 443-445.

［4］趙德育，葛傳生，田曼，等.呼吸道合胞病毒感染對(duì)豚鼠肺組織M受體變化的影響［J］.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2002，22( 5) : 379-381，400.

［5］Hu CP，Katrin W，Alexander A，et al.Nerve growth factor and nerve growth fator receptors in respiratory syncytial virus-infected lungs［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2002，283( 2) : 494-502.

［6］林敏娟，胡成平，吳鄂生，等.支氣管哮喘大鼠肺組織中白血病抑制因子的表達(dá)變化［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2003，26 ( 11) : 727-728.

［7］沈華浩，王蘋莉.支氣管哮喘小鼠模型應(yīng)用評(píng)價(jià)［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2005，28( 4) : 284-286.

［8］唐曉媛，于化鵬，鄧火金，等.不同劑量致敏原對(duì)小鼠哮喘模型氣道反應(yīng)性的影響［J］.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2011，39( 2) : 121-125.

［9］廉國(guó)利，俞海國(guó)，趙曉東，等.小鼠呼吸道合胞病毒感染模型的建立［J］.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2003，24( 4) : 329-332.

［10］田曼，葛傳生.呼吸道合胞病毒感染的動(dòng)物模型［J］.中國(guó)抗感染化療雜志，2001，1( 4) : 244-246.

［11］Freund-Michel V，F(xiàn)rossard N.The nerve growth factor and its re ceptors in airway inflammatory diseases［J］.Pharmacol Ther 2008，117( 1) : 52-76.

［12］Woolf CJ.Phenotypic modification of primary sensory neurons: the role of nerve growth factor in the production of persistent pain.Philosophical Transections of the Royal society of London series B ［J］.Biological Science，1996，351( 1338) : 441-448.

［13］Kinght D，Aprile AC，Spalding LJ，et al.Leukaemia inhibitory factor( LIF) upregulates excitatory non-adrenergic non-cholinergic and maintains chonlinergic neural function in tracheal explant ［J］.Br J Pharmacol，2000，130( 5) : 975-979.

［14］余巍巍，楊新官.哮喘大鼠肺內(nèi)神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)變化及與病理改變的關(guān)系［J］.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2012，33( 1) :65-67.

［15］馮凈凈，胡蕓文，宋志剛，等.呼吸道合胞病毒感染小鼠Th17細(xì)胞亞群的變化［J］.中國(guó)呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志，2013，12( 1) :49-54.

［16］歐陽若蕓，胡成平，朱錦琪，等.神經(jīng)生長(zhǎng)因子及其受體在哮喘大鼠肺組織的變化以及對(duì)氣道炎癥的影響［J］.中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2005，30( 6) : 660-665.

收稿日期:( 2015-02-12)

通信作者:武怡，E-mail: 2858643598@ qq.com

文章編號(hào):1002-266X( 2015) 32-0032-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

中圖分類號(hào):R-332

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.012