徐宏業(yè),喬博亞,張 杰,鮑志宇,秦豪杰,莫耀南
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bFGF在百草枯誘導(dǎo)大鼠肺纖維化過(guò)程中的表達(dá)
徐宏業(yè)1,喬博亞2,張杰1,鮑志宇1,秦豪杰1,莫耀南1
摘要:目的探討堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)在百草枯誘導(dǎo)大鼠肺纖維化組織中的表達(dá)及其作用。方法健康清潔雄性SD大鼠45只,體質(zhì)量(350±20) g,分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組大鼠腹腔注射10 mg·kg-1百草枯溶液,對(duì)照組大鼠注射等滲鹽水。實(shí)驗(yàn)組大鼠分為1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、21 d、28 d組,每組5只,按觀察時(shí)間分批處死,對(duì)照組大鼠飼養(yǎng)28 d后處死。觀察每組大鼠肺形態(tài)學(xué)變化,肺組織蘇木精-伊紅(HE)和Masson染色,免疫組化SP法檢測(cè)bFGF在大鼠肺組織中的表達(dá)。 結(jié)果染毒后大鼠出現(xiàn)異常行為變化;肺組織3 d出現(xiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),5 d時(shí)膠原纖維增生,14 d時(shí)肺泡周?chē)灰?guī)則膠原纖維明顯增多,28 d時(shí)肺明顯纖維化,膠原纖維廣泛分布。bFGF免疫組化染色示染毒大鼠支氣管黏膜上皮、肺泡壁上皮、炎性細(xì)胞以及肺泡腔內(nèi)的巨噬細(xì)胞內(nèi)bFGF呈陽(yáng)性表達(dá),且隨著時(shí)間變化,其表達(dá)逐漸增高,而至28 d時(shí)稍減弱。結(jié)論百草枯中毒后肺纖維化,隨著時(shí)間的推移程度不斷加深。bFGF在百草枯大鼠肺纖維化過(guò)程中表達(dá)上調(diào),至28 d時(shí)稍減弱,其可能參與百草枯大鼠肺纖維化過(guò)程,其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。
關(guān)鍵詞:百草枯;肺纖維化;大鼠;bFGF
百草枯(paraquat,PQ),化學(xué)名稱(chēng)為1-1-二甲基-4-4-聯(lián)吡啶陽(yáng)離子鹽,分子式為C12H14N2’2Cl,分子量為257.2 Da。PQ是有機(jī)雜環(huán)類(lèi)接觸性除草劑,因其除草效果良好而在我國(guó)農(nóng)村被廣泛使用。但自PQ使用以來(lái),世界各地出現(xiàn)大量的中毒病例,甚至在亞洲、加勒比海地區(qū)和太平洋島國(guó),口服百草枯成為一種常見(jiàn)的自殺方式[1-3]。PQ有著極強(qiáng)的毒性,且沒(méi)有有效的治療方式,致死率很高。Hwang等報(bào)道PQ中毒的病死率為40%~50%,國(guó)內(nèi)為85%~95%,肺是百草枯作用的主要靶器官,其機(jī)制是百草枯毒素在富氧的肺組織中氧化,中性粒細(xì)胞大量積聚,產(chǎn)生大量的氧自由基,造成肺泡的損傷。主要表現(xiàn)為早期肺泡上皮細(xì)胞受損,肺泡出血、水腫,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),晚期則出現(xiàn)肺不可逆性纖維化。而且,百草枯中毒非急性死亡的病人大多在15~30 d發(fā)生肺纖維化。
堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族中的一員,它在人體中的分布非常廣泛,主要分布于腦、肝、心臟、腎、骨、甲狀腺、軟骨等組織,還分布于單核巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞、成肌細(xì)胞和星形細(xì)胞等。純化的bFGF是一條單鏈,含有146個(gè)氨基酸,其基因位于人類(lèi)染色體的4q25處,基因長(zhǎng)約38 kb[9-10]。bFGF具有強(qiáng)大的促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖的作用,能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增生和膠原纖維的合成、可以激活內(nèi)皮細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)等[11]?;赽FGF的功能作用,其在百草枯致肺纖維化過(guò)程中可能具有一定的意義。
本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立百草枯誘導(dǎo)肺纖維化模型, HE及Masson染色觀察其組織病理學(xué)改變,應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)bFGF在大鼠肺組織中的表達(dá),探討百草枯致肺纖維化的病理過(guò)程及bFGF在其中的可能機(jī)制,為后續(xù)進(jìn)一步的百草枯中毒機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。
1材料和方法
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料健康清潔雄性SD大鼠45只,體質(zhì)量(350±20) g ,由河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。百草枯純品購(gòu)于美國(guó)Fluka公司,Masson染色試劑盒購(gòu)于北京Solarbio科技有限公司,兔抗大鼠bFGF多克隆抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司,兔Streptavidin-HRP試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。
1.2模型建立健康清潔雄性SD大鼠 45只,分為1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、21 d、28 d組和空白對(duì)照組,每組5只。實(shí)驗(yàn)組大鼠腹腔一次性注射百草枯溶液,給藥劑量為10 mg·kg-1;對(duì)照組大鼠同樣方法腹腔注射等滲鹽水。觀察大鼠染毒后的行為學(xué)改變,每天2次。實(shí)驗(yàn)組大鼠分別于第1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、21 d、28 d分批處死,對(duì)照組大鼠飼養(yǎng)28 d后處死。所有大鼠脫頸處死后剖胸觀察肺外觀并取出肺,4%多聚甲醛液固定,石蠟包埋,切片(片厚4 μm),蘇木精-伊紅(HE)和Masson染色觀察肺組織病理學(xué)改變和肺纖維化情況。
1.3免疫組化染色石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化,經(jīng)抗原修復(fù)(0.01 M枸櫞酸鈉緩沖溶液,微波熱修復(fù))、3% H2O2孵育去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,滴加山羊血清封閉液。每片滴加bFGF多克隆抗體(1∶300稀釋)50 μL,37 ℃孵育2 h,PBS沖洗3 min×3次。每片滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液50 μL,37 ℃孵育1 h,PBS沖洗3 min×3次。每片滴加HRP標(biāo)記的鏈酶親和素50 μL,37 ℃孵育30 min,PBS沖洗3 min×3次。DAB顯色3 min。蘇木素復(fù)染,中性樹(shù)膠封固。陰性對(duì)照用PBS替代一抗。
2結(jié)果
2.1大鼠行為學(xué)觀察正常對(duì)照組大鼠活潑好動(dòng),肥碩強(qiáng)壯。實(shí)驗(yàn)組大鼠染毒6 h后即出現(xiàn)呼吸急促,鼻翼扇動(dòng)明顯,少活動(dòng),呈匍匐狀態(tài),腹式呼吸明顯而幅度大;且隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng),動(dòng)物出現(xiàn)前爪抹鼻,毛發(fā)缺乏光澤且直立不倒伏,食欲差;部分大鼠動(dòng)作遲緩,活動(dòng)減少,出現(xiàn)皮膚發(fā)紺,神志差,走路左右搖晃不定、小心翼翼等癥狀。
2.2肺組織形態(tài)觀察正常對(duì)照組大鼠肺部呈鮮紅色,質(zhì)地柔軟,切面無(wú)出血。實(shí)驗(yàn)組大鼠在腹腔注射百草枯1~3 d,肺體積稍增大,肺邊緣變鈍圓,質(zhì)地柔軟,呈紅褐色,散在點(diǎn)養(yǎng)廉瘀斑,輕觸后切面有泡沫狀液體滲出;腹腔注射百草枯5~14 d,肺組織有不同程度的萎縮,顏色暗紅,質(zhì)地稍硬,輕觸后切面有較少的液體滲出;腹腔注射百草枯21~28 d,肺組織萎縮嚴(yán)重,部分肺組織表面凹凸不平,質(zhì)地變硬,顏色蒼白,肺部分區(qū)域出現(xiàn)明顯的瘢痕組織。
2.3肺組織HE與Masson染色HE染色結(jié)果顯示,1 d組大鼠肺組織除肺間質(zhì)小血管及肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張充血外,其余與正常對(duì)照大鼠肺組織沒(méi)有明顯差異;Masson染色顯示肺間質(zhì)除部分細(xì)支氣管周?chē)馕匆?jiàn)有膠原纖維。3 d組大鼠肺組織HE染色顯示肺泡隔增寬,肺間質(zhì)小血管及肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張充血,少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),部分肺泡腔內(nèi)見(jiàn)大量淡紅染水腫液;Masson染色顯示肺泡隔內(nèi)未見(jiàn)有明顯膠原纖維。5 d組大鼠肺組織HE染色顯示肺泡隔增寬,炎性細(xì)胞增多,部分肺泡腔內(nèi)出血;Masson染色顯示肺泡隔內(nèi)有少量淡藍(lán)色膠原纖維。7 d組大鼠肺組織HE染色結(jié)果基本與5 d組相同,肺間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),部分肺泡萎陷;Masson染色顯示肺泡隔中顯藍(lán)色的膠原纖維增多。
10 d組大鼠肺組織HE染色顯示肺泡隔增粗明顯,部分肺泡腔萎陷,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);Masson染色顯示肺泡隔膠原纖維增多。14 d組大鼠肺組織HE染色顯示肺泡間隔進(jìn)一步增寬,間質(zhì)小血管淤血明顯,部分肺泡萎陷實(shí)變(見(jiàn)圖1);Masson染色顯示肺泡隔內(nèi)膠原纖維較前增多(見(jiàn)圖2)。
圖2 染毒14 d,肺間質(zhì)膠原纖維增多(Masson,×100)
21 d組大鼠肺組織HE染色顯示肺組織實(shí)變,肺泡形態(tài)已不易分辨;Masson染色顯示肺組織實(shí)變,大量膠原纖維沉積。28 d組大鼠肺組織HE染色顯示肺組織實(shí)變嚴(yán)重,難見(jiàn)到正常的肺泡腔(見(jiàn)圖3);Masson染色顯示膠原纖維廣泛分布,呈不規(guī)則排列,肺纖維化明顯(見(jiàn)圖4)。
2.4bFGF在肺組織表達(dá)免疫組化染色結(jié)果顯示大鼠肺組織內(nèi)bFGF多克隆抗體陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物呈棕黃色細(xì)顆粒狀,陰性對(duì)照均未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)。空白對(duì)照組在支氣管黏膜上皮、支氣管平滑肌和肺泡上皮有少量弱陽(yáng)性表達(dá),肺間質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)(見(jiàn)圖5)。實(shí)驗(yàn)組大鼠在染毒初期bFGF的分布與表達(dá)強(qiáng)弱與正常對(duì)照組相比未見(jiàn)明顯差異。染毒5 d后 bFGF在支氣管黏膜上皮、肺泡壁上皮等處呈陽(yáng)性表達(dá),在部分炎性細(xì)胞及肺泡巨噬細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈弱陽(yáng)性表達(dá)(見(jiàn)圖6)。隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng),陽(yáng)性反應(yīng)逐漸增強(qiáng),染毒14 d后,bFGF在支氣管黏膜上皮、肺泡上皮及部分區(qū)域肺泡間質(zhì)等處呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),在部分血管壁平滑肌及炎性細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)呈陽(yáng)性表達(dá)(見(jiàn)圖7)。染毒28 d后,肺組織實(shí)變明顯,bFGF表達(dá)較前減弱,主要分布于支氣管黏膜上皮、部分血管壁平滑肌及炎性細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)(見(jiàn)圖8)。
圖3 染毒28 d,肺組織實(shí)變(HE,×100)
圖4 染毒28 d,肺實(shí)變,可見(jiàn)大量膠原纖維(Masson,×100)
圖5 bFGF在正常大鼠支氣管黏膜上皮、支氣管平滑肌和
圖6 染毒5 d,bFGF在支氣管黏膜上皮、肺泡壁上皮等處
圖7 染毒14 d,bFGF在支氣管黏膜上皮、肺泡上皮及部分
圖8 染毒28 d,bFGF表達(dá)較前稍減弱(SP,×400)
3討論
百草枯是一種在我國(guó)應(yīng)用比較廣泛的除草劑,其中毒可引起多種臟器的損害,尤其以肺臟損害最為嚴(yán)重,急性期可導(dǎo)致肺充血、急性水腫,肺透明膜形成、增生變性等[12],非急性死亡的病人大多在中毒后15~30 d發(fā)生肺纖維化,預(yù)后較差。本研究PQ中毒大鼠表現(xiàn)出動(dòng)作遲緩,自主活動(dòng)能力降低,活動(dòng)減少,震顫、豎尾、豎毛。
HE和Masson染色顯示隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng),肺組織的損傷越來(lái)越重。在中毒早期(染毒1~3 d),主要表現(xiàn)為急性肺淤血、急性肺水腫,部分肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)少量出血,中性粒細(xì)胞開(kāi)始增多。在中期(染毒5~14 d),隨著時(shí)間的延長(zhǎng),出現(xiàn)慢性炎癥,局部區(qū)域可見(jiàn)纖維組織增生。其機(jī)制可能是過(guò)量的氧自由基生成并誘導(dǎo)了炎性因子的損害作用,肺表面活性物質(zhì)在不斷減少,而膠原纖維在不斷增生,導(dǎo)致肺萎縮、塌陷,彈性降低,肺的呼吸作用不斷喪失,最終會(huì)出現(xiàn)明顯纖維化。在終末期(染毒21~28 d),肺組織大部分區(qū)域肺泡萎陷實(shí)變,大量膠原纖維沉積,最終形成纖維化。其結(jié)果和部分研究[5-7]基本一致,但從前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,使用純品百草枯染毒大鼠時(shí)使用劑量更易控制,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率也明顯降低,故使用百草枯純品來(lái)制作肺纖維化模型更適宜于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。
bFGF是一種能廣泛地促進(jìn)來(lái)源于中胚層及神經(jīng)外胚層細(xì)胞增殖的生物活性物質(zhì),其生理功能相當(dāng)廣泛。其生物活性不僅能夠促進(jìn)神經(jīng)組織、軟組織等的損傷修復(fù),促進(jìn)新生血管形成,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)及肢體再生等等,它與器官纖維化的關(guān)系近年來(lái)亦引起關(guān)注。已有研究表明,肝纖維化[13]、腎纖維化[14]、系統(tǒng)性硬化癥[15]等均與bFGF有關(guān),且對(duì)纖維化有促進(jìn)作用。bFGF對(duì)成纖維細(xì)胞有著強(qiáng)烈的促增殖效應(yīng)。本組中bFGF在大鼠染毒5 d后表達(dá)開(kāi)始升高,并且隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng),陽(yáng)性表達(dá)逐漸增強(qiáng),至染毒28 d后,肺組織實(shí)變明顯,bFGF表達(dá)較前有所減弱。這與成纖維細(xì)胞增殖、膠原纖維沉積的過(guò)程基本一致,說(shuō)明bFGF參與了大鼠肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。也即在損傷、炎癥的刺激作用下,支氣管黏膜上皮、肺泡壁上皮、炎性細(xì)胞以及肺泡腔內(nèi)的巨噬細(xì)胞內(nèi)bFGF表達(dá)水平上調(diào),促進(jìn)肺組織內(nèi)成纖維細(xì)胞增殖并分泌膠原纖維,最終促使肺纖維化形成,其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。
綜上所述,本實(shí)驗(yàn)成功建立了百草枯致大鼠肺纖維化模型,并且隨著時(shí)間的推移,百草枯誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化程度不斷加深。而且,bFGF在百草枯大鼠肺纖維化過(guò)程中表達(dá)上調(diào),至28 d時(shí)稍減弱,提示bFGF可能參與百草枯大鼠肺纖維化過(guò)程,其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。
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Expression of bFGF in Process of Pulmonary Fibrosis
Induced by Paraquat in Rats
XU Hong-ye,QIAO Bo-ya,ZHANG Jie,et al
(College of Forensic Medicine,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)
Abstract:ObjectiveTo establish the model of pulmonary fibrosis by paraquat(PQ) in rats and investigate the expression of basic fibroblast growth factor(bFGF) in the pulmonary fibrosis induced by PQ.Methods45 healthy male SD rats were divided into 1 d,3 d,5 d,7 d,10 d,14 d,21 d,28 d, and blank control group with 5 rats in each group. Rats in the experimental group were intraperitoneally injected with 10 mg·kg-1PQ solution, and the control group was injected isotonic saline solution. Rats in the experimental group were sacrificed at observation time, and the control group was fed 28 d. The pulmonary morphology changes, hematoxylin eosin staining (HE) and Masson staining of lung tissues were observed, and the immunohistochemistry method was used to detect the expression of bFGF protein in lung tissues of rats.ResultsAfter exposure of PQ the rat appears abnormal behavior in experimental group. The neutrophil infiltration were observed in rats after exposure of PQ 3 d, and proliferation of fibroblasts after 5 d, and the irregular collagen fibers were obviously increased surrounding the alveolar after 14 d. Pulmonary fibrosis was formed obviously after 28 d. In the experimental group,the positive expression of bFGF was found in the cytoplasm of inflammatory cell, bronchial mucosal epithelium and alveolar wall. Furthermore, the positive expression of bFGF was increased with exposure time until to 28 d, and then that was slightly decreased.ConclusionThe typical pulmonary fibrosis was induced by PQ poisoning, and the degree of pulmonary fibrosis
河南科技大學(xué)大學(xué)生研究訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(2014240)
作者單位:1.河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院,河南洛陽(yáng) 471003
2.商丘市公安局梁園分局,河南商丘 476000
was continuously aggravated with exposure time. The expression of bFGF was increased with exposure time of PQ until to 28 d, and then that was decreased. Its mechanism need to be further studied.
Key words:paraquat;pulmonary fibrosis;rat;bFGF
通信作者:莫耀南,男,教授,E-mail:forensic@haust.edu.cn
作者簡(jiǎn)介:徐宏業(yè)(1990-),女,河南南陽(yáng)人,從事法醫(yī)病理學(xué)研究工作。
收稿日期:2015-09-01
基金項(xiàng)目:河南省教育廳基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(14B310001)
中圖分類(lèi)號(hào):R595.4,R563.9
文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A
文章編號(hào):1672-688X(2015)04-0244-05