黑果枸杞質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

艾則孜江·艾爾肯1，2，田志浩1，馮孟鑫1，馬愷悅1，劉春生1，馬長華1*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京100102； 2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，烏魯木齊830054)

摘要：目的建立黑果枸杞的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。方法采用HPLC-DAD(高效液相色譜法-二極管陣列檢測器)，以C18 ODS 80 Ts QA(150 mm×4.9 mm，7 μm)為色譜柱，以100 mL·L`(-1) 甲酸溶液(1 mL·L`(-1) 三氟乙酸)-乙腈(150 mL·L`(-1)甲醇)為流動相，梯度洗脫，檢測波長525 nm，流速1.0 mL·min`(-1)，柱溫：30 ℃，對黑果枸杞中花青素類天然色素成分進行了半定量分析及指紋圖譜研究。采用HPLC-ELSD(高效液相色譜法-蒸發(fā)光檢測器)，以Hypersil NH2(150 mm×4.2 mm，5 μm) 柱為色譜柱，以四氫呋喃-甲醇-30 mL·L`(-1)三氟乙酸(61∶30∶9)為流動相,等度洗脫，流速為1.0 mL·min`(-1),載氣流速為2.5 mL·min`(-1)，漂移管溫度是90 ℃；柱溫22 ℃，對甜菜堿成分進行定量分析。結(jié)果花青素類成分在2.725~27.25 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系， r=0.999 9)；平均回收率為101.6%， RSD為1.0%；花青素類成分指紋圖譜有 13個共有峰，方法學(xué)考察結(jié)果良好，各產(chǎn)地黒果枸杞指紋圖相似度都大于0.99。甜菜堿在2.07~20.68 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(r=0.999 7),平均回收率為101.1%， RSD為1.4%。結(jié)論所建立的方法可靠、穩(wěn)定，可用于黒果枸杞質(zhì)量的全面評價。

關(guān)鍵詞：花青素；甜菜堿;黒果枸杞；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.03.006

中圖分類號：R284

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1004-2407(2015)03-0236-06

Abstract:ObjectiveTo establish the quality standard for Lycium ruthenicum Murray by HPLC.Methods The fingerprints and determination of anthocyanins composition of Lycium ruthenicum Murray were performed by HPLC with C18 ODS 80 Ts QA (150 mm×4.9 mm， 7 μm) by gradient elution. The solvent system consisted of 100 mL·L`(-1) formic acid solution (1 mL·L`(-1) trifluoroacetic acid)-acetonitrile(150 mL·L`(-1) methanol). The detection wavelength was set at 525 nm， the flow rate was 1.0 mL·min`(-1)， and the column temperature was maintained at 30 ℃. The determination of betaine was performed by HPLC-ELSD with Hypersil NH2(250 mm×4.2 mm，5 μm) column by isocratic elution. The solvent system consisted of tetrahydrofuran-methanol-30 mL·L`(-1) trifluoroacetic acid(61∶30∶9)， the flow rate of carrier gas was 2.5 mL·min`(-1)， the flow rate of solvent was 1 mL·min`(-1)， drift tube temperature was 90 ℃， and the column temperature was maintained at 22 ℃. Results The calibration curve of cyanidin-3-O-glucoside chloride was linear in the range of 2.725-27.25 μg (r=0.999 9). The average recovery rate was 101.6% (n=6)，with RSD 1.0%. The calibration curve of betaine was linear in the range of 2.07-20.68 μg (r =0.999 7). The average recovery rate was 101.1% (n=6)，with RSD 1.4%.Conclusion The method is rapid， accurate and reliable， and the method can be used as the quality standard for Lycium ruthenicum Murray.

作者簡介：艾則孜江·艾爾肯，男，碩士研究生

收稿日期：(2014-11-17)

Research on the quality standard ofLyciumruthenicumMurray

Aizezijiang AIERKEN1， 2， TIAN Zhihao1， FENG Mengxin1， MA Kaiyue1， LIU Chunsheng1， MA Changhua1*(1. School of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China； 2. Department of Pharmacy， the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China)

Key words: anthocyanin； betaine;LyciumruthenicumMurray； quality standard

*通信作者：馬長華，男，教授，碩士生導(dǎo)師

茄科植物黑果枸杞(LyciumruthenicumMurray)的成熟果實在我國傳統(tǒng)民族醫(yī)藥中占有非常重要的地位。根據(jù)藏醫(yī)學(xué)經(jīng)典《晶珠本草》中的詳細(xì)記載：黑果枸杞味甘，性平，清心熱，對心臟發(fā)熱、心臟疾病、月經(jīng)不調(diào)[1]、更年期綜合征等的治療具有顯著療效。近年來，黑果枸杞的療效受到了廣泛的關(guān)注，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黑果枸杞的生理活性與花青素類天然色素、甜菜堿等成分有關(guān)[2-5]。黑果枸杞中含有大量水溶性色素，具有清除自由基、抗氧化、延緩衰老等作用，可用于醫(yī)藥、食品、化妝品的加工生產(chǎn)，具有很高的開發(fā)利用價值。甜菜堿是枸杞果、葉、柄中所含的主要生物堿之一，在體內(nèi)起甲基供體作用，是枸杞中對脂質(zhì)代謝或抗脂肪肝作用的主要活性物質(zhì)。黑果枸杞主產(chǎn)于新疆喀什、莎車縣、阿勒泰、蜻河縣、青海格爾木、諾木洪等地區(qū)。目前，黑果枸杞有野生資源及栽培資源，資源豐富，但目前尚沒有建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。綜合考慮黑果枸杞藥理活性物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制的全面性，本文對黑果枸杞中花青素類成分及甜菜堿的含量進行了半定量、指紋圖譜及定量分析，為黑果枸杞的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1儀器與試藥

1.1儀器Waters1525高效液相色譜儀，配置：泵Waters1525、檢測器Waters 2998、自動進樣器2707； KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山舒美超聲儀器有限公司)；METTLER AE 240電子分析天平(d=0.01 mg)(梅特勒-托利多國際貿(mào)易上海有限公司)；SARTFORUIS AG BS(d=0.1 mg)電子分析天平(梅特勒-托利多國際貿(mào)易上海有限公司)。

1.2試藥乙腈、甲醇、四氫呋喃，色譜級(美國Fish公司)；三氟乙酸，色譜純，(德國Merck公司)；甲酸、無水乙醇，分析純( 北京化工廠)；超純水；其他試劑皆為分析純；甜菜堿對照品(中國食品藥品檢定院，批號110894-200503)；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(四川省維克奇生物科技有限公司，批號MUST-13061802)；黑果枸杞干燥果實分別收集于新疆蜻河縣、青海諾木洪、新疆蜻河縣、青海格爾木、青海諾木洪、青海諾木洪、新疆阿勒泰、新疆喀什和青海格爾木，共9份。

2方法與結(jié)果

2.1花青素類成分半定量分析

2.1.1色譜條件C18ODS 80 Ts QA 色譜柱(150 mm×4.9 mm，7 μm，Tosoh，Tokyo，Japan)[6-11]；流動相為100 mL·L-1甲酸溶液(1 mL·L-1三氟乙酸)-乙腈(150 mL·L-1甲醇)，進行梯度洗脫，見表1；檢測波長：525 nm；流速：1 mL·min-1；進樣體積：10 μL；柱溫：30 ℃。此色譜條件下，各類花青素成分的分離度均大于 1.5，見圖 1。

表1梯度洗脫條件

Tab.1 The gradient elution program

t/min有機相/%水相/%039788923020803525754039745397

圖1高效液相色譜圖

A.矢車菊素-3-O-葡萄糖苷；B.黑果枸杞

Fig.1 HPLC chromatograms

A.cyanidin-3-O-glucoside chloride B.sample

2.1.2對照品溶液的制備精密稱定矢車菊素-3-O-葡萄糖苷15.8 mg，置于10 mL的量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得對照品母液。取適量對照品溶液，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為0.545 mg·mL-1的對照品溶液。

2.1.3供試品溶液的制備取1.0 g過80 目篩的黑果枸杞粉末，加入4 mL甲醇(20 mL·L-1甲酸)避光浸提3次，每次4 h。離心處理，轉(zhuǎn)速5 000 r·min-1，離心10 min。合并提取液，置于25 mL量瓶中，加甲醇(20 mL·L-1甲酸)稀釋至刻度。低溫避光放置，備用。

2.1.4線性關(guān)系考察取2.1.2項下的對照品溶液，分別進樣5，10，20，30，40和 50 μL，得峰面積，分別以對照品進樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)、測得的峰面積為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，所得原花青素線性回歸方程：Y=92 973X-20 288，r=0.999 5。結(jié)果表明，原花青素在2.725～27.25 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5精密度實驗取2.1.2項下的對照品溶液，連續(xù)進樣6次，每次20 μL，測定峰面積，結(jié)果原花青素峰面積的RSD為0.09%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.1.6穩(wěn)定性實驗精密稱定9號樣品1.0 g，共6份，按2.1.3制得供試品溶液，取供試品溶液分別于0，2，4，8，10和12 h，精密吸取20 μL注入液相色譜儀進行分析。結(jié)果花青素類色譜峰總峰面積的RSD為0.61%，表明12 h內(nèi)供試品溶液具有良好的穩(wěn)定性。

2.1.7重復(fù)性實驗分別精密稱定9號樣品1.0 g，按2.1.3配制供試品溶液， 各精密吸取20 μL注入液相色譜儀進樣分析，結(jié)果花青素類成分色譜峰總峰面積的RSD為0.20%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8加樣回收率實驗精密稱取黑果枸杞9號樣品6份，每份0.5 g，置于10 mL離心管中，再分別加入對照品16.3 mg，按2.1.3項下方法制備，在1.3.3項下色譜條件下，進樣分析，計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2花青素回收率測定結(jié)果

Tab.2 Results of recovery tests of cyanidin-O-glucoside chloride

稱樣量/g樣品量/mg加入量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%0.500118.916.3100.990.499618.916.3101.980.501418.916.3100.000.500218.916.3101.980.502718.916.3102.970.499318.916.3101.98101.61.0

2.1.9花青素類成分半定量分析結(jié)果精密稱取每批樣品3份，每份1 g，按2.1.3項下相同的方法分別制備供試品溶液，各精密吸取10 μL注入液相色譜儀，測定原花青素峰面積，計算含量。結(jié)果見表3。 結(jié)果表明，青海格爾木花青素類含量最高，為37.83 mg·g-1，新疆喀什花青素類含量最低，為9.28mg·g-1。

表3樣品含量測定結(jié)果

Tab.3 Results of samples determination

編號產(chǎn)地原花青素含量/mg·g-1RSD/%1新疆精河縣19.301.382青海諾木洪20.801.513新疆蜻河縣15.931.364青海格爾木31.491.825青海諾木洪22.701.216青海諾木洪35.971.387新疆阿勒泰35.411.428新疆喀什 9.281.919青海格爾木37.831.42

2.2花青素類成分指紋圖譜研究

2.2.1色譜條件色譜條件同2.1.1。

2.2.2供試品溶液的制備供試品制備條件同2.1.3。

2.2.3穩(wěn)定性實驗分別精密稱定9號樣品1.0 g，共6份，按2.1.3配制供試品溶液，取供試品溶液分別于0，2，4，8，10和12 h，精密吸取20 μL注入液相色譜儀進行分析。結(jié)果各共有色譜峰保留時間和相對峰面積的RSD分別為0～1.75%和0～2.86%，RSD均小于3.0%，符合色譜指紋圖譜要求，表明12 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.2.4重復(fù)性實驗分別精密稱定9號樣品1.0 g，按2.1.3配制供試品溶液， 各精密吸取20 μL注入液相色譜儀進樣分析，結(jié)果各共有色譜峰保留時間和相對峰面積的RSD分別為0～0.19%和0～2.75%；RSD均小于3. 0%，符合色譜指紋圖譜要求，表明重復(fù)性良好。

2.2.5花青素類指紋圖譜分析結(jié)果在上述色譜條件下9號樣品共得到13個花青素類色譜峰(全波長掃描各個色譜峰最大吸收波長均為520~530 nm，因此確定為花青素類)，且各個色譜峰分離度皆大于1.5。將9批藥材所得的色譜數(shù)據(jù)一次導(dǎo)入由國家藥典委員會推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2004A版)》，疊加圖譜。以S1號批次樣品譜圖作為參照譜進行指紋匹配，得到9批樣品的共有模式圖,見圖2。將生成的共有模式譜圖作為對照譜圖，分別計算9批樣品的相似度依次為0.998，0.994，0.993，0.998，0.996，0.992，0.993，0.993和0.990。結(jié)果顯示，9批樣品的相似度均大于0.990，說明黑果枸杞藥材化學(xué)成分種類相似，質(zhì)量比較穩(wěn)定。

圖29批黑果枸杞樣品指紋圖譜

Fig.2 The fingerprint of nine batches ofLyciumruthenicumMurray

2.3黒果枸杞中甜菜堿的含量測定

2.3.1色譜條件儀器型號安捷倫1100，Alltech 3300 ELSD，Hypersil NH2色譜柱(250 mm ×4.2 mm，5 μm)；流動相:四氫呋喃-甲醇-30 mL·L-1三氟乙酸(61∶30∶9)[12]；流速為1.0 mL·min-1；漂移管溫度為90 ℃；柱溫為22 ℃；進樣體積:10 μL。色譜圖見圖3。

圖3高效液相色譜圖

A.甜菜堿對照品；B.黑果枸杞

Fig.3 HPLC chromatograms

A.betaine；B.sample

2.3.2對照品溶液的制備精密稱取甜菜堿對照品10 mg，置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，取適量對照品溶液，加甲醇稀釋成2.068 mg·mL-1溶液，備用。

2.3.3供試品溶液的制備精密稱取藥材細(xì)粉1.0 g，精密稱定，置于50 mL錐形瓶中，加甲醇25 mL，超聲處理1 h，濾過，藥材殘渣加甲醇25 mL，重復(fù)上述超聲及濾過過程，合并濾液，將濾液置于沸水浴中濃縮后轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得供試品溶液。

2.3.4線性關(guān)系考察分別精密吸取2.3.2項下的對照品溶液1，2，4，5，6，8和10 μL，以甜菜堿質(zhì)量的對數(shù)值為橫坐標(biāo)、測得峰面積的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，甜菜堿線性回歸方程：Y=1.127 4X+2.788 4，r=0.999 7。結(jié)果表明，甜菜堿在2.07~20.68 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5精密度實驗精密吸取2.3.2項下配制的對照品溶液，連續(xù)進樣6次，每次5 μL，記錄峰面積，甜菜堿峰面積的RSD為1.95%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.6穩(wěn)定性實驗取9號樣品，按2.3.3項下制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，10和12 h精密吸取10 μL注入液相色譜儀，測定其峰面積。結(jié)果甜菜堿峰面積的RSD為2.10%。結(jié)果表明，供試品溶液中3種成分在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7重復(fù)性實驗取9號樣品6份，按2.3.3項下方法制成供試品溶液， 各精密吸取10 μL注入液相色譜儀，測定其峰面積，計算含量。結(jié)果甜菜堿平均含量的RSD為2.33%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性好。

2.3.8加樣回收率實驗精密稱取黑果枸杞樣品6份，每份0.5 g，置于10 mL量瓶中，再加入甜菜堿對照品0.50 mg，按2.3.3項下方法制備，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，在2.3.1色譜條件下，進樣，平均加樣回收率為101.1%，RSD為1.4%，具體見表4。

表4甜菜堿加樣回收率

Tab.4 Results of recovery tests of betaine

稱樣量/g甜菜堿加入量/mg含量/mg加樣回收率/%平均值/%RSD/%0.50160.501.18102.690.50280.501.15100.10.50230.501.17102.470.50480.501.18100.910.50320.501.1699.130.49980.501.19101.47101.11.4

2.3.9甜菜堿含量測定取同一批樣品6份，按2.3.3項下方法制成供試品溶液， 各精密吸取10 μL注入液相色譜儀，測定其峰面積，計算含量。結(jié)果見表5。黑果枸杞甜菜堿含量為618.6~1 185.3 μg·g-1。

表5不同產(chǎn)地樣品甜菜堿含量測定結(jié)果

Tab.5 Results of samples determination

編號產(chǎn)地甜菜堿含量/mg·g-1RSD/%1新疆精河縣1139.31.522青海諾木洪667.80.563新疆蜻河縣1185.31.024青海格爾木741.81.275青海諾木洪618.60.216青海諾木洪1139.91.437新疆阿勒泰744.70.018新疆喀什 826.01.889青海格爾木1136.30.70

3討論

根據(jù)2010年版《中國藥典》規(guī)定，紅枸杞的含量測定項有甜菜堿及多糖，多糖測定采用紫外-可見分光光度法，甜菜堿采用薄層色譜法。以此為參考依據(jù)進行黑果枸杞的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立。黑果枸杞干燥果實為干燥皮囊，幾乎無黏度，經(jīng)查閱文獻得知，黑果枸杞多糖雖有一定藥理活性，但含量低[13]，故本研究暫未對黑果枸杞多糖含量進行測定。本實驗通過對甜菜堿結(jié)構(gòu)、物理性質(zhì)的分析及預(yù)實驗，由結(jié)果可知，甜菜堿屬于極性較大的化合物，且無紫外吸收或具有末端吸收。通過閱讀相關(guān)文獻，發(fā)現(xiàn)薄層色譜法具有一定的缺陷，如操作繁瑣[14]、重復(fù)性較差[15-16]等，同時發(fā)現(xiàn)也有應(yīng)用高效液相色譜法對甜菜堿進行含量測定，綜合考慮，本實驗采用HPLC-ELSD對黑果枸杞中甜菜堿進行含量測定。通過方法學(xué)證明，該方法穩(wěn)定，結(jié)果準(zhǔn)確。大量文獻報道，花青素類具有廣泛的藥理活性，故本實驗將花青素類作為質(zhì)量控制指標(biāo)。綜合考慮紅枸杞與黑果枸杞的差異性與相似性，黑果枸杞標(biāo)準(zhǔn)的測定項目應(yīng)體現(xiàn)黑果枸杞的獨特性質(zhì)。本研究對黑果枸杞中花青素類及甜菜堿的含量進行了測定，為黑果枸杞的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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