陳恩慧，秦　鈺，李蘊哲，廖予菲，趙新鋒*

(1.西北大學生命科學學院中藥學系，西安　710069；2.陜西國際商貿(mào)學院醫(yī)藥學院，西安　710086)

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正交設(shè)計結(jié)合響應(yīng)曲面法研究白芥子中芥子堿的提取工藝

陳恩慧1，秦鈺1，李蘊哲1，廖予菲2，趙新鋒1*

(1.西北大學生命科學學院中藥學系，西安710069；2.陜西國際商貿(mào)學院醫(yī)藥學院，西安710086)

摘要：目的建立測定白芥子中芥子堿含量的高靈敏質(zhì)譜方法，進一步優(yōu)化并獲得藥材中芥子堿的最佳提取工藝。方法高效液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜法測定芥子藥材中芥子堿的含量，以芥子堿含量為指標，以熱醇回流為提取方法，采用正交設(shè)計和響應(yīng)曲面2種方法優(yōu)化白芥子藥材中芥子堿的提取工藝。結(jié)果芥子堿質(zhì)量濃度在15.5～294.5 μg·mL-1范圍內(nèi)提取離子峰峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，方法檢測限為0.1 ng·mL-1，白芥子中芥子堿的最佳提取工藝為：40倍量體積分數(shù)為65%的乙醇，60 ℃加熱回流提取5.0 h。結(jié)論高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有特異性強的特點，可作為白芥子中芥子堿的含量測定方法；正交設(shè)計結(jié)合響應(yīng)曲面法能準確確定白芥子中芥子堿的最佳提取工藝，能為其他中藥提取工藝的優(yōu)化提供借鑒。

關(guān)鍵詞：白芥子；芥子堿；高效液相色譜；質(zhì)譜；正交設(shè)計；響應(yīng)曲面法

白芥子為十字花科(Cruciferae)1～2年生草本植物白芥Brassicaalba(L.) Bois.的干燥成熟種子，在止咳、平喘和化痰方面具有獨特的療效[1-2]。芥子堿為季銨鹽類生物堿，已被廣泛作為白芥子藥材質(zhì)量控制研究的重要指標[3]。文獻檢索發(fā)現(xiàn)，芥子堿的含量測定方法主要包括高效液相色譜法[4-6]、毛細管電泳法[7]和電化學方法[8]。然而，作為芥子堿含量測定的主要方法，高效液相色譜法依然存在分析時間長和靈敏度低(0.1 mg·L-1)的問題[9-10]。本論文建立了基于高效液相色譜-離子阱多級質(zhì)譜反應(yīng)模式的白芥子中芥子堿的含量測定方法，并用該方法結(jié)合正交設(shè)計及響應(yīng)曲面法對芥子堿的提取工藝進行了優(yōu)化，以期為復雜樣品中芥子堿的高靈敏快速分析及其制備提供方法學借鑒。

1儀器與試藥

1.1儀器Agilent 1100系列高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(美國安捷倫公司)；BS224S型萬分之一電子天平(德國賽多利斯公司)；TGL-16G高速離心機(上海安寧科學儀器公司)。

1.2試藥白芥子藥材購于西安市萬壽路藥材市場，經(jīng)西北大學生命科學學院房敏峰教授鑒定為十字花科植物白芥Brassicaalba(L.) Boi的干燥成熟種子；芥子堿硫氰酸鹽對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號171241-201006)；色譜純乙腈(美國Fisher公司)；其他試劑除特別說明外均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1樣品制備

2.1.1對照品溶液的配制準確稱取芥子堿硫氰酸鹽對照品粉末12.5 mg，置于5.0 mL量瓶中，加5.0 mol·L-1甲酸水溶液充分溶解并定容至刻度，4 ℃冷藏，備用。

2.1.2藥材供試品溶液的制備稱取白芥子藥材10.0 g，60 ℃烘箱干燥至恒質(zhì)量，粉碎，過40目篩。取5.0 g藥材粉末包裹于脫脂棉中，放入索氏提取裝置，石油醚加熱脫脂12 h后，轉(zhuǎn)移至表面皿中揮干石油醚。準確稱取脫脂后藥材粉末1.0 g，加入30.0 mL體積分數(shù)為65%的乙醇溶液，冷浸20 min，加熱回流提取1 h，減壓蒸干，加5.0 mol·L-1的甲酸水溶液定容至50.0 mL，微孔濾膜(0.45 μm)濾過，4 ℃冷藏備用，進樣前稀釋1 000倍。

2.2分析條件

2.2.1色譜條件色譜柱：Agilent TC-C18柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流速：0.8 mL·min-1，檢測波長：326 nm；流動相：5.0 mol·L-1甲酸水-乙腈(30︰70)；進樣體積：5.0 μL；柱溫：25 ℃。

2.2.2質(zhì)譜條件電噴霧正離子模式電離；霧化氣壓力：35 psi；干燥氣流速：8.0 L·min-1；干燥氣溫度：350 ℃；毛細管電壓：4 500 V；質(zhì)量掃描范圍m/z：100～500。擬定色譜條件下，芥子堿對照品溶液和白芥子藥材供試品溶液色譜圖見圖1。

圖1提取離子流圖

A. 對照品；B. 供試品

Fig.1 Extract ion chromatograms

A. reference standard；B. sample

3結(jié)果與討論

3.1方法學考察

3.1.1線性范圍精密吸取芥子堿對照品溶液10，0，70，100，130，160和190 μL，用5.0 mol·L-14的甲酸水溶液定容至1.0 mL量瓶中，配制成質(zhì)量濃度分別為15.5，62.0，108.5，155.0，201.5，248.0和294.5 mg·mL-1的芥子堿標準溶液。擬定色譜條件下，準確吸取5.0 μL，進樣以m/z310.3→251.2為選擇離子對，采用多級反應(yīng)模式進行峰面積的測定，以提取離子峰峰面積為縱坐標、質(zhì)量濃度為橫坐標進行回歸，得回歸方程：Y=0.000 2X+0.049 1，r=0.999，表明芥子堿質(zhì)量濃度在15.5～294.5 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.1.2精密度精密吸取白芥子藥材供試品液5.0 μL，連續(xù)進樣5次，測得芥子堿硫氰酸鹽質(zhì)量濃度依次為403.6，405.7，401.2，404.2和404.8 μg·mL-1。求得相對標準偏差RSD為0.4%。結(jié)果表明，該方法具有較好的精密度。

3.1.3穩(wěn)定性取白芥子藥材供試品液5份，在0，1，2，4和6 h后，分別進樣5.0 μL，測得芥子堿質(zhì)量濃度依次為407.9，402.6，404.8，406.6和405.1 μg·mL-1。求得RSD為0.5%。結(jié)果表明，芥子堿在擬定條件下可穩(wěn)定存在6 h。

3.1.4重復性平行稱取白芥子藥材粉末5份，按藥材供試品溶液制備方法制備樣品，分別進樣5.0 μL，測得芥子堿質(zhì)量濃度分別為406.9，401.0，403.2，405.6和402.1 μg·mL-1。計算RSD為0.6%。結(jié)果表明，該方法重復性良好。

3.1.5回收率平行稱取5份經(jīng)脫脂處理的白芥子藥材，分別加入質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1的芥子堿對照品溶液0.1 mL，按照2.1.2項下方法制備白芥子藥材供試品溶液。進樣5.0 μL，測得芥子堿質(zhì)量濃度分別為812.3，804.2，805.7，810.2和803.6 μg·mL-1，進一步計算芥子堿的平均回收率為98.5%。結(jié)果表明，該方法具有較好的回收率。

3.2提取工藝優(yōu)化

3.2.1正交設(shè)計設(shè)定乙醇體積分數(shù)、料液比、回流時間和溫度4項為考察因素，體積分數(shù)分別為A1(35%)，A2(65%)，A3(95%)；料液比分別為B1(1∶20)，B2(1∶30)，B3(1∶40)；回流時間分別為C1(4.0 h)，C2(4.5 h)，C3(5.0 h)；溫度D1(60 ℃)，D2(80 ℃)，D3(100 ℃)。結(jié)果見表1。

由表3可見：回流時間和溫度對芥子堿得率無顯著性影響，而乙醇體積分數(shù)及料液比對芥子堿得率影響顯著。各因素對芥子堿提取率影響大小順序為A>B>D>C。在所有因素中，醇體積分數(shù)對芥子堿得率影響最大。芥子堿的最佳提取工藝組合為A2B3C3D1。該結(jié)果說明，白芥子藥材中芥子堿的最佳提取工藝為：40倍量體積分數(shù)為65%的乙醇，60 ℃下熱回流5 h。

表1熱醇回流法正交實驗結(jié)果

Tab.1 Experimental results of orthogonal design for extracting sinapine by reflux with heat ethanol

序號ABCD質(zhì)量濃度/μg·mL-111111486.021222552.331333586.942123524.052231635.262312599.173132369.783213426.293321489.4Ij1.631.381.511.61IIj1.761.611.571.52G=4.67IIIj1.291.681.591.54CT=2.42Ij/30.540.460.500.54IIj/30.590.530.520.51IIIj/30.430.560.530.51Sj0.040.020.000.00方差來源偏差平方和自由度 均差F顯著性A0.0420.0226.12*B0.0220.0110.68*C0.0020.000.74D0.0020.001.00

注：F0.01(2，2)=99；F0.05(2，2)=19.0；F0.1(2，2)=9.0；*為顯著，**為極顯著

3.2.2響應(yīng)曲面法參考正交設(shè)計分析結(jié)果，選定α(乙醇體積分數(shù))、β(料液比)和t(溫度)3個因素，以δ(芥子堿濃度)為響應(yīng)值，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化白芥子藥材中介子堿的提取工藝(圖2)，提取方案及結(jié)果見表2。

圖2三維響應(yīng)曲面圖

A.乙醇體積分數(shù)與料液比；B.乙醇體積分數(shù)與溫度；C.溫度與料液比

Fig.1 Three dimensional response curves

A.ethanol volume fraction and material ratio；B.ethanol volume fraction and temperature；C. temperature and material ratio

表2芥子堿提取響應(yīng)面法實驗結(jié)果

Tab.2 Results of the extraction of sinapine by response surface methodology

序號乙醇體積分數(shù)/%料液比/mL·g-1溫度/℃芥子堿質(zhì)量濃度/μg·mL-11352060466.02952060369.13354060586.94954060429.45353040561.96953040493.77353080559.88953080426.29652040561.610654040569.111652080524.112654080612.113653060631.214653060635.615653060634.416653060633.317653060629.1

采用多參數(shù)擬合法對表4數(shù)據(jù)進行分析，得回歸方程：γ=0.63-0.057α+0.035β-8.013×10-3t-0.015αβ-0.016αt+0.02βt-0.11α2-0.057β2-9.222×10-3t2。應(yīng)用Design Expert軟件得到該回歸模型進行方差分析，得P<0.000 1，R2=0.982 4，一次項α、β及二次項α2、β2對提取率的影響均達到極顯著水平，其余各項均顯著，說明響應(yīng)回歸模型具有較高的顯著水平和良好的擬合度。

3.2.3白芥子最佳提取工藝驗證精密稱取3份經(jīng)石油醚脫脂處理的白芥子藥材，每份0.2 g，按照最佳提取工藝進行處理，獲得供試品溶液，在擬定分析條件下，測得芥子堿的質(zhì)量濃度分別為698.3，697.6和695.2 μg·mL-1。計算RSD為1.0 %。

4小結(jié)

本論文以芥子堿硫氰酸鹽為指標，以m/z310.3→251.2為選擇離子對，建立了白芥子藥材中指標成分芥子堿含量測定的高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜方法。與傳統(tǒng)液相色譜方法相比[11]，該方法由于采用了基于選擇離子對的多級反應(yīng)檢測模式，不僅能有效排除藥材中共存物質(zhì)的干擾，而且顯著提高了分析速度和檢測靈敏度，具有特異性強和分析速度快的特點，有望為白芥子復方及其生物樣品等復雜體系中芥子堿的高靈敏快速測定提供方法學借鑒。

響應(yīng)曲面法是目前進行待測指標提取工藝優(yōu)化研究的經(jīng)典方法之一[12-13]。該方法以回歸方程作為函數(shù)估算的主要依據(jù)，能以多項式函數(shù)的形式描述各因子和響應(yīng)值之間的相互影響，并進行優(yōu)化。因此，該模型已經(jīng)發(fā)展成為藥學和化學工程領(lǐng)域優(yōu)化加工工藝參數(shù)和反應(yīng)條件的有效數(shù)學方法之一。本文在經(jīng)典正交設(shè)計研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，以芥子堿硫氰酸鹽為指標，采用響應(yīng)曲面法對白芥子中芥子堿的提取工藝進行了優(yōu)化，證明該方法可用于優(yōu)化中藥有效成分提取過程中的各影響因素水平及交互作用。與經(jīng)典的均勻設(shè)計及正交設(shè)計相比，該方法由于考慮了各因素水平間的交互作用，在穩(wěn)定性和工作量方面具有簡易、科學和合理的特點，為準確快速地確定中藥復雜樣品中目標成分的提取工藝提供了方法。

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Study on the extraction procedure of sinapine in white mustard seed by orthogonal design and response surface methodology

CHEN Enhui1，QIN Yu1，LI Yunzhe1，LIAO Yufei2，ZHAO Xinfeng1*(1.Department of Traditional Chinese Medicine，College of Life Science， Northwest University，Xi′an 710069， China；2.Medicinal School，Shaanxi Institute of International Trade and Commerce，Xi′an 710086，China)

Abstract:ObjectiveTo develop a high sensitive method for the determination of sinapine in white mustard seed and to optimize the extraction procedure of sinapine. MethodsThe content of sinapine in white mustard seed was determined by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Then the concentration of sinapine was used as an index to optimize the ethanol extraction procedure of sinapine from white mustard seed by orthogonal design and response surface methodology. ResultsThe area of extracting peak of sinapine was linearly corresponded to its concentrations in the range of 15.5-294.5 μg·mL-1.The detection limit of the method was 0.1 ng·mL-1. The optimized conditions were confirmed to be 5 h of heating reflux by forty folds of 65% ethanol at 60 ℃. ConclusionHigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry has the advantages of high specificity. This property enables it to become the preferable method for measuring sinapine in white mustard seed. The combination of orthogonal design with response surface methodology is capable of establishing the optimized extracting procedure of sinapine in white mustard seed.

Key words:White mustard seed；sinapine；HPLC；mass spectrometry； orthogonal design；response surface methodology

收稿日期：(2015-06-18)

通信作者：*趙新鋒，男，副教授

作者簡介：陳恩慧，女，在讀本科生

基金項目：國家自然科學 (編號：21475103， J1210063)；教育部長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃(編號：IRT1174)；陜西省重點科技創(chuàng)新團隊計劃(編號：2013KCT-24)；陜西省自然科學基金(編號：2015JM2072)。

中圖分類號：R284

文獻標志碼：A

文章編號：1004-2407(2016)01-0008-05

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.01.003