余宗濤，　張吉才，　高　瓊，　高　波，　胡春卉

5-氮-2′-脫氧胞苷對肺癌A549細(xì)胞凋亡及范可尼貧血互補(bǔ)基團(tuán)F表達(dá)的影響

余宗濤1，張吉才1，高瓊2，高波1，胡春卉1

(1. 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 十堰 442000；

2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北 十堰 442000)

摘要：目的探討5-氮-2′-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)對人肺癌A549細(xì)胞凋亡及抑癌基因范可尼貧血互補(bǔ)基團(tuán)F(FANCF)基因表達(dá)的影響。方法以濃度為0.5、5、50 μmol/L的5-Aza-CdR處理人肺癌細(xì)胞株A549，常規(guī)培養(yǎng)采用四唑鹽(MTT)比色法觀察細(xì)胞的生長活性，甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測FANCF基因甲基化狀態(tài)；以熒光定量PCR檢測FANCF mRNA的表達(dá)，并用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果5-Aza-CdR能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長，細(xì)胞增殖抑制率(CPIR)隨5-Aza-CdR濃度和作用時(shí)間的不同而變化，呈劑量依賴性(P<0.005)和時(shí)間依賴性(P<0.001)；藥物處理后FANCF mRNA表達(dá)明顯升高，細(xì)胞凋亡率與5-Aza-CdR劑量呈正相關(guān)(r=0.998, P<0.05)。結(jié)論5-Aza-CdR能使FANCF基因去甲基化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)抑癌功能，但同時(shí)有增加順鉑耐藥的風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)鍵詞：范可尼貧血互補(bǔ)基團(tuán)F基因；甲基化；5-氮-2′-脫氧胞苷；A549細(xì)胞；凋亡

Influence of 5-Aza-CdR on the apoptosis of lung cancer A549 cell and the expression ofFANCFgeneYUZongtao1，ZHANGJicai1，GAOQiong2，GAOBo1，HUChunhui1

.(1.DepartmentofClinicalLaboratory,TaiheHospital,HubeiUniversityofMedicine,HubeiShiyan442000,China; 2.DepartmentofRespiratoryMedicine,TaiheHospital,HubeiUniversityofMedicine,HubeiShiyan442000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the influence of 5-Aza-2′-deoxycytidine(5-Aza-CdR) on the apoptosis of lung cancer A549 cell and the expression of Fanconi anemia complementation group F(FANCF) gene. MethodsA549 cells were treated with 5-Aza-CdR(0.5, 5 and 50 μmol/L, respectively). The growth of A549 cells was observed by 3-(4,5-dimethylthiazol)-3,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay. The methylation status of FANCF gene was observed by methylation specific polymerase chain reaction(PCR). The expression of FANCF mRNA was observed by fluorescence quantitation PCR. The apoptosis rate of A549 cells was analyzed by flow cytometry. ResultsA549 cells treated with 5-Aza-CdR displayed a slow growth. The rate of cell proliferation inhibiting (CPIR) for A549 cells changed with the concentration and treatment time of 5-Aza-CdR (P<0.005, P<0.001). FANCF mRNA expression increased after treatmert. The apoptosis rates after treatment had a positive correlation with 5-Aza-CdR dose (r=0.998, P<0.05). Conclusions5-Aza-CdR can induce the apoptosis of A549 cells by inducing demethylation and thereby enchancing FANCF gene, enhancing tumor suppressor function, but it can increase the risk of resistance to cisplatin.

Key words:Fanconi anemia complementation group F gene; Methylation; 5-Aza-2′-deoxycytidine; A549 cell; Apoptosis

對于肺癌術(shù)后及不能手術(shù)的肺癌患者，化療是重要的治療手段，而化療耐藥是臨床面臨的重要難題。最近研究證實(shí)，腫瘤抑制基因異常表達(dá)不僅在腫瘤形成過程中具有重要作用，而且對化療耐藥也有重要影響。目前順鉑在肺癌化療治療中占有重要地位，順鉑的主要靶點(diǎn)是DNA，其引起DNA交聯(lián)損傷和斷裂，干擾DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，而DNA損傷修復(fù)能力則是腫瘤細(xì)胞對鉑類耐藥的重要分子基礎(chǔ)。近年研究顯示，范可尼貧血(Fanconi anemia, FA)途徑在DNA交聯(lián)損傷中發(fā)揮了重要作用[1]，范可尼貧血互補(bǔ)基團(tuán)F(Fanconi anemia complementation group F,FANCF)基因可激活FA/乳腺癌(breast carcinoma，BRCA)易感基因途徑功能蛋白，進(jìn)而實(shí)施DNA交聯(lián)損傷的修復(fù)[2]，因此FA/BRCA途徑參與了腫瘤細(xì)胞對順鉑的耐藥機(jī)制。甲基化是引起FANCF基因功能缺失的主要機(jī)制之一，而FANCF基因在肺癌A549細(xì)胞系中存在異常甲基化，我們實(shí)驗(yàn)觀察了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮-2′-脫氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-CdR)處理前后肺癌A549細(xì)胞的增殖活性、凋亡及FANCF基因甲基化狀態(tài)和mRNA表達(dá)水平變化，旨在探討DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制藥物在治療由異常甲基化致使基因失活而導(dǎo)致肺癌發(fā)生、發(fā)展及化療藥物耐藥中的作用及機(jī)制。

材料和方法

一、材料

人肺腺癌細(xì)胞株(A549)及人肺腺癌細(xì)胞順鉑耐藥株(A549/DDP)細(xì)胞系(武漢大學(xué)細(xì)胞庫)；5-Aza-CdR和二甲亞砜(sigma-aldrich corporation,美國)；RPMI1640培養(yǎng)基(Life Technologies Corporation,Gibco, 美國)；Trizol試劑(Life Technologies Corporation,Invitrogen,美國)；A3500逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega Corporation，Madison，WI,美國)；聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增試劑盒(上海生物工程股份有限公司)；FANCFmRNA、FANCF甲基化及非甲基化、GAPDHmRNA引物合成見表1(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)；酶標(biāo)儀PHomo(鄭州安圖生物工程股份有限公司)；PE7500(Life Technologies Corporation,美國)；XL流式細(xì)胞儀(Beckman-Coulter Corporation,美國)；碘化丙啶(北京泛博生物化學(xué)有限公司)；核糖核酸酶(北京華美生物工程有限公司)；Marker(MD109,北京天根生化科技有限公司)

二、方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)將A549/DDP細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞傳代24 h后，分別加入0.5、5和50 μmol/L(終濃度)的5-Aza-CdR繼續(xù)培養(yǎng)，24、48和72 h后分別收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1　FANCF甲基化、非甲基化、mRNA及GAPDH mRNA引物序列

2. 細(xì)胞增殖活性檢測采用四唑鹽[3-(4,5)-dimethylthiazol-3,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]比色法。取對數(shù)生長期細(xì)胞，每孔200 μL培養(yǎng)液(約含2×103個(gè)細(xì)胞)接種于96孔培養(yǎng)板，共接種5板，每組6孔，接種24 h后棄上清，加入含5-Aza-CdR濃度為0.5、5和50 μmol/L的培養(yǎng)液放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，于24、48和72 h分別取一板，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，去除孔內(nèi)上清液，每孔加入二甲亞砜，震蕩10 min，在酶標(biāo)儀上于570 nm處測各孔吸光度(A)值。增殖能力以平均A值分析，繪制細(xì)胞增殖活性曲線，以未加5-Aza-CdR干預(yù)的細(xì)胞為陰性對照。細(xì)胞增殖抑制率(cellular proliferation inhibition rate, CPIR)=(對照組A均值-試驗(yàn)組A均值)/對照組A均值×100%。

3. 細(xì)胞凋亡率檢測采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞傳代24 h后棄上清加入含5-Aza-CdR濃度為0.5、5和50 μmol/L培養(yǎng)液，待72 h后分別回收細(xì)胞，以胰酶消化離心收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌3次，70%冰乙醇-20℃過夜固定，離心去固定液，再用4℃預(yù)冷PBS洗滌2次，核糖核酸酶(ribonuclease,RNaseA，終濃度0.1 g/L)37℃溫育30 min，加入0.05 g/L碘化丙啶1 mL，4℃避光染色30 min后上機(jī)檢測，測定細(xì)胞凋亡率。

4.FANCFmRNA表達(dá)測定采用熒光定量-逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)測定，收集各試驗(yàn)組細(xì)胞，加入1 mL TrizolRNA提取液提取RNA，再用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒A3500逆轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)為內(nèi)對照，測定FANCFmRNA相對含量。FANCFmRNA/GAPDHmRNA=(1+EGAPDH)Ct(GAPDH)/(1+EFANCF)Ct(FANCF)，EGAPDH及EFANCF為PCR擴(kuò)增效率。

5. 甲基化特異性PCR檢測FANCF基因甲基化狀態(tài)提取的基因組DNA取4 μg，經(jīng)變性、堿基修復(fù)、脫鹽回收、脫去磺化基團(tuán)以及預(yù)冷酒精回收等步驟收集修飾后的DNA用于PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：2 mmol/L dNTP 1.5 μL、25 mmol/L Mg2+2.4 μL、5 U/μL Taq 0.3 μL、10×Buffer 3 μL、上下游引物各2 μL、樣本5 μL，10×SYBR-GreenⅠ1.5 μL，用無菌水補(bǔ)齊體積共30 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；95℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min,共30個(gè)循環(huán)；最后一循環(huán)于72℃ 8 min。同時(shí)測定其熔點(diǎn)曲線。甲基化與非甲基化判斷標(biāo)準(zhǔn)：甲基化特異引物對有擴(kuò)增目標(biāo)片段者(153 bp)為甲基化；未甲基化特異引物對有擴(kuò)增目標(biāo)片段且甲基化特異引物對無擴(kuò)增目標(biāo)片段者(153 bp)為未甲基化[5-6]。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用方差分析，兩兩比較用SNK法檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、 MTT試驗(yàn)檢測5-Aza-CdR對A549細(xì)胞增殖的影響

隨著5-Aza-CdR濃度的增加，CPIR逐漸增強(qiáng)(P<0.05)；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，CPIR亦逐漸增強(qiáng)(P<0.001)。見表2。

表2　不同濃度的5-Aza-CdR培養(yǎng)不同時(shí)間

注：與5-Aza-CdR 5 μmol/L組比較，*P<0.05；與5-Aza-CdR 50 μmol/L組比較，#P<0.05；與培養(yǎng)48 h比較，△P<0.001；與培養(yǎng)72 h比較，▲P<0.001

二、 5-Aza-CdR干預(yù)前后細(xì)胞凋亡率的變化

經(jīng)不同濃度5-Aza-CdR誘導(dǎo)72 h后，對照組(5-Aza-CdR 0 μmol/L組)A549細(xì)胞凋亡率為(2.5±0.34)%；5-Aza-CdR 0.5 μmol/L組為(13.37±0.26)%；5-Aza-CdR 5 μmol/L組為(23.77±1.62)%；5-Aza-CdR 50 μmol/L組為(39.38±1.54)%。各組間兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。相關(guān)性分析顯示細(xì)胞凋亡率與5-Aza-CdR劑量呈正相關(guān)(r=0.998,P<0.05)。

三、不同濃度5-Aza-CdR處理A549細(xì)胞后FANCFmRNA表達(dá)情況

以0 μmol/L組為對照，隨著5-Aza-CdR濃度的增加，A549細(xì)胞中FANCFmRNA表達(dá)量相應(yīng)增加(P<0.001)；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，F(xiàn)ANCFmRNA表達(dá)量相應(yīng)增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3　不同濃度5-Aza-CdR對A549細(xì)胞內(nèi)FANCF mRNA表達(dá)的影響

注：與5-Aza-CdR 0 μmol/L組比較，*P<0.001；與5-Aza-CdR 0.5 μmolL/L組比較，#P<0.001

四、A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞FANCFmRNA表達(dá)情況

A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞FANCFmRNA表達(dá)的相對定量值分別為0.070 3±0.057 4和0.728 6±0.159 9，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

五、FANCF基因表達(dá)及甲基化電泳圖

A549/DDP細(xì)胞株FANCF基因甲基化陰性，5-Aza-CdR處理前后FANCFmRNA表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而A549細(xì)胞株FANCF基因甲基化陽性，5-Aza-CdR處理前后FANCFmRNA表達(dá)量差異明顯。見圖1和圖2。

注：M為FANCF基因甲基化引物擴(kuò)增產(chǎn)物；U為FANCF基因非甲基化引物擴(kuò)增產(chǎn)物；mRNA為FANCFmRNA；GAPDH為內(nèi)對照；Marker為相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品；1、3、5和7泳道為未加入5-Aza-CdR細(xì)胞培養(yǎng)；2、4、6和8泳道為加入5-Aza-CdR細(xì)胞培養(yǎng)

圖1A549/DDP細(xì)胞株FANCF甲基化及表達(dá)電泳圖

注：M為FANCF基因甲基化引物擴(kuò)增產(chǎn)物；U為FANCF基因非甲基化引物擴(kuò)增產(chǎn)物；mRNA為FANCFmRNA；GAPDH為內(nèi)對照；Marker為相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品；1、3、5和7泳道為未加入5-Aza-CdR細(xì)胞培養(yǎng)；2、4、6和8泳道為加入5-Aza-CdR細(xì)胞培養(yǎng)

圖2A549細(xì)胞株FANCF甲基化及表達(dá)電泳圖

討論

近年來，肺癌發(fā)病率和死亡率呈急劇上升趨勢，而化療耐藥已成為當(dāng)今腫瘤治療中亟待解決的一大難題。隨著表觀遺傳學(xué)研究的深入，研究認(rèn)為某些基因啟動(dòng)子甲基化與腫瘤耐藥關(guān)系密切，可用于預(yù)測腫瘤化療療效。近年研究顯示，F(xiàn)A/BRCA途徑在腫瘤細(xì)胞對DNA交聯(lián)劑類藥物(如順鉑、絲裂霉素、米爾法蘭等)的耐藥中發(fā)揮了重要作用。FANCF作為FA家族中的銜接蛋白，其C末端與FANCA/FANCG亞單位相連，其N端與FANCC/FANCE亞單位相連，在泛素化的FANCD2入核過程中有著重要作用，F(xiàn)ANCF既是穩(wěn)定FA復(fù)合體，也是維持FA/BRCA通路生物學(xué)功能的關(guān)鍵因子。由于FANCF基因定位于11p15，而該位點(diǎn)具有一定數(shù)量的腫瘤相關(guān)印記基因，其主要特點(diǎn)是富含CpG島，易被高度甲基化，目前研究發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中均可檢測到FANCF基因甲基化，從而導(dǎo)致基因表達(dá)降低或缺失[7]。而FANCF表達(dá)對FA/BRCA途徑完整發(fā)揮細(xì)胞修復(fù)功能起重要的作用，F(xiàn)ANCF基因的表達(dá)下降或缺失會導(dǎo)致FA/BRCA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑缺陷，細(xì)胞DNA修復(fù)受損，引起染色體異位、倒位、缺失和基因異常擴(kuò)增等，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生；同時(shí)由于FANCF基因的表達(dá)降低或沉默引起FA/BRCA通路失活，喪失對抗腫瘤藥物致DNA損傷的修復(fù)作用，引起腫瘤細(xì)胞的死亡，增強(qiáng)化療藥物的敏感性。ZHAO等[8]用RNAi干預(yù)FANCF基因在人乳腺癌細(xì)胞的表達(dá)證實(shí)，隨FANCF表達(dá)量的降低，癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性增加。

5-Aza-CdR是一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，能與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合，降低DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的生物活性，進(jìn)而降低甲基化水平[9]，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，故5-Aza-CdR常被用來治療由于啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致基因表達(dá)降低或缺失而引起的疾病。本研究結(jié)果顯示，隨著濃度的增加及培養(yǎng)時(shí)間的延長，5-Aza-CdR 對A549細(xì)胞的CPIR增強(qiáng)，提示5-Aza-CdR作用于FANCF甲基化的A549細(xì)胞株可能通過降低DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性，提高FANCF基因非甲基化率。細(xì)胞凋亡率與5-Aza-CdR濃度相關(guān)，組間差異明顯；在人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中FANCF基因啟動(dòng)子甲基化陽性，其mRNA表達(dá)明顯降低，而在順鉑耐藥A549/DDP細(xì)胞系中表達(dá)顯著高于A549細(xì)胞株，提示肺癌順鉑耐藥可能與FANCF基因高表達(dá)有關(guān)。應(yīng)用5-Aza-CdR藥物干預(yù)后，A549細(xì)胞FANCFmRNA表達(dá)增高，但對A549/DDP細(xì)胞株作用不顯著，證明增加5-Aza-CdR濃度可增加FANCFmRNA表達(dá)，進(jìn)一步表明5-Aza-CdR可使由于甲基化而導(dǎo)致表達(dá)沉默/降低的FANCF基因重新表達(dá)，恢復(fù)其功能，保證細(xì)胞完整性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但可引起對順鉑的耐藥。

本研究證實(shí)啟動(dòng)子甲基化可導(dǎo)致FANCF基因沉默，而FANCF表達(dá)缺失或降低又與肺癌發(fā)生、發(fā)展及順鉑類化療藥物療效相關(guān)。DNA甲基化在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞增殖分化、腫瘤發(fā)生和發(fā)展等方面都起重要的作用。5-Aza-CdR作為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑不但應(yīng)用于體外細(xì)胞去甲基化，而且在白血病、骨髓增生異常綜合征、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤臨床治療中已經(jīng)取得很好的療效。在本研究中5-Aza-CdR可以使A549細(xì)胞系FANCF基因啟動(dòng)子去甲基化，基因轉(zhuǎn)錄激活，因此A549細(xì)胞系FANCF基因啟動(dòng)子去甲基化可能是一種潛在的有效藥物位點(diǎn)。對于那些失去手術(shù)機(jī)會，又不能耐受化療藥物的不良作用患者，使用5-Aza-CdR就可能成為延長患者生存時(shí)間的新手段，當(dāng)然這需要臨床試驗(yàn)更進(jìn)一步證實(shí)。

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(本文編輯：姜敏)

收稿日期：(2014-06-11)

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)05-0507-05R446.62

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.05.022

通訊作者：高瓊，聯(lián)系電話：0719-8801750。

作者簡介：余宗濤，男，1971年生，碩士，副主任技師，主要從事腫瘤分子機(jī)制研究。

基金項(xiàng)目：湖北省十堰市科技局資助項(xiàng)目(ZD2012015)；湖北醫(yī)藥學(xué)院優(yōu)秀中青年科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2011CXG02)